切梢小蠹属(Tomicus spp.)隶属于鞘翅目(Coleoptera)象虫科(Curculionidae)小蠹亚科(Scolytinae)，主要危害云南松(Pinus yunnanensis)、马尾松(P.massoniana)、思茅松(P.kesiya)、华山松(P.armandii)、高山松(P.densata)等松类植物。目前发现的切梢小蠹共有8个种，其中T.puellus、多毛切梢小蠹(T.pilifer)和短毛切梢小蠹(T.brevipilosus)仅在亚洲地区发生为害; 纵坑切梢小蠹(T.piniperda)和横坑切梢小蠹(T.minor)广布于亚洲和欧洲地区; T.destruens主要分布于环地中海地区; 云南纵坑切梢小蠹(T.yunnanensis)和华山松切梢小蠹(T.armandii)主要分布在我国西南地区。我国地域广阔，物种分布也很丰富，除T.destruens外，其余7种切梢小蠹在我国均有分布(李丽莎等，1997; Kirkendall et al., 2008; Li et al., 2010)。

国内对切梢小蠹属分类的系统研究仅见于殷惠芬等(1984)编撰的《中国经济昆虫志》第二十九册，其中仅记载了纵坑切梢小蠹，多毛切梢小蠹和横坑切梢小蠹3个种类，远远不能满足科研和森防工作的需要。Faccoli(2006)筛选了8个形态学特征用于切梢小蠹的分类鉴定研究，并成功地将纵横切梢小蠹和T.destruens 2个种区分开来。Kirkendall等(2008)构建了7种切梢小蠹的分类检索表，其所用形态学特征比较复杂:一些特征在个体间存在差异(如体长、体色)，一些特征需要严格的观察条件(如触角刚毛分布及前足胫节特征)，在分类实践中难以实施，李霞等(2009)初步提出一套形态学分类系统，并基于分子和形态观察发现一疑似新种。

20世纪60年代后，现代生物技术成为研究种群分类的有力工具。尽管小蠹种类的最终确定需要找到形态学差异，但是最初对小蠹种类的质疑多是以分子水平的差异为基础的。T.destruens在外形及生态学上与纵坑切梢小蠹十分相似，常被认为是后者的一个生态型，其分类地位一直存在争议。直到通过DNA分析发现二者在分子系统发育水平上聚为两大类，T.destruens才被作为区别于纵坑切梢小蠹的种独立存在(Gallego et al., 2001)。云南纵坑切梢小蠹的发现完全依赖于分子生物学方法的应用。云南地区危害云南松的切梢小蠹种群一直被认为是纵坑切梢小蠹，尽管有研究发现其生物学特征与其他地区发现的纵坑切梢小蠹明显不同(Ye et al.，1997; Långström et al., 2002; Lieutier et al., 2003; 李丽莎等，1997; 2006; 李青青等，2007; 叶辉，1996; 1999;叶辉等，2004)。Duan等(2004)发现该种群与其他切梢小蠹在分子系统发育水平上聚为两大类，应该是一新种。Kirkendall等(2008)找到形态学特征差异并将其命名为T.yunnanensis。

不同的种类在防治技术上存在较大差异，特别是小蠹类害虫通常采用化学信息素进行监测和防治，种类识别上的错误可能造成防效差甚至完全失败的后果，因此开展切梢小蠹虫的分类鉴定工作是开展其生物生态学研究、精确监控、预测和防治工作的基础。本研究针对我国的切梢小蠹种类，在已有研究基础上，结合分子生物学方法，扩大样品观察数量，进一步规范形态学特征，探索建立一套快速、稳定可靠的分类鉴定系统，为基层林业工作者提供简便准确的鉴定方法。

1 材料与方法 1.1 形态学鉴定 1.1.1 供试材料

2008年9月—2010年12月，分别从3省23个县采集800余头切梢小蠹样品(表 1)。每个样地分别从枝梢中收集30~50头样品(部分地区样品不足30头)，并迅速保存至无水乙醇中。云南楚雄地区样品采自华山松; 四川理县和山东泰安样品采自油松(P.tabulaeformis); 其他样品均采自寄主云南松。

1.1.2 形态鉴别特征筛选

本试验将收集到的全部样品分别在Nikon体视显微镜下观察。观察特征包括Kirkendall等(2008)和Faccoli(2006)采用的体长、体色、触角锤状部、前足胫节、鞘翅斜面第二沟间部特征、前胸背板刻点及刚毛分布。比较各种形态学特征的稳定性及对观察放大倍数、光源条件的要求。筛选稳定性高、观察条件简单的特征做切梢小蠹属分类探讨。

1.2 分子生物学验证方法 1.2.1 供试材料

从经形态学鉴定的样品中分别选取5个以上样品(收集到的样品少于5个的则选取全部样品)用于分子鉴定，进而检验形态学鉴定的准确性。

1.2.2 基因组提取及PCR扩增

取单头小蠹的胸部用于基因组DNA的提取，DNA提取应用天根生化科技(北京)有限公司生产的试剂盒DP304-2，按照说明书步骤操作。采用Jordal等(2008)和Duan等(2004) 引物对28Sscol1/D3R对rDNA的28S亚基的拓展区D2区进行扩增，引物序列如下:28Sscol1:5'-AACGAAAGGTCGAAGGAAG-3'和D3R:5'-TAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3'。PCR反应条件:94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

1.2.3 PCR产物的序列测定与分析

PCR产物直接测序，测序工作由北京华大基因生物技术有限公司完成。所测序列应用软件DNAMAN6进行拼接。应用GeneBank中的BLAST进行同源序列搜索，并应用软件Clustal W对所有序列进行比对。以黑山大小蠹(Dendroctonus ponderosae)(AF308385) 为外群，利用MEGA3.1分子进化遗传分析软件的最大简约法(MP)和邻接法(NJ)进行系统发育关系分析，节点支持率使用500次bootstrap检验。黑山大小蠹(AF308385) 的序列信息从GenBank数据库中获得。遗传距离的计算采用软件DNAMAN6的Juke-Cantor模型。

2 结果与分析 2.1 形态学鉴定结果

最终选用体视显微镜30倍条件下可以清楚观察的3个形态特征:一是鞘翅斜面第2沟间部的瘤状颗粒和刻点分布; 二是鞘翅斜面刚毛长短; 三是前胸背板刻点及刚毛分布(图 1)。利用以上3个特征对全部样品进行鉴定，共发现云南纵坑切梢小蠹363头，纵坑切梢小蠹20头，横坑切梢小蠹215头，短毛切梢小蠹156头，多毛切梢小蠹30头和华山松切梢小蠹30头，没有发现T.puellus。

2.2 分子鉴定结果

用于分子生物学鉴定的样品包括13头云南纵坑切梢小蠹、8头纵横切梢小蠹、9头横坑切梢小蠹、7头短毛切梢小蠹和10头华山松切梢小蠹。样品多毛切梢小蠹DNA存在降解现象，未获得序列。最终用于比对的序列长度为559bp，比对得到的碱基，存在差异的序列分别命名为云南纵坑切梢小蠹1-6、短毛切梢小蠹1-5、横坑切梢小蠹1-2、纵坑切梢小蠹1-3和华山松小蠹1。序列已提交到GeneBank中(登录号为GU176322-GU176338)，从GeneBank中搜索到的28S同源序列AY570828，AY570820，AY570832经DNAMAN裁切成同等长度后用于分子系统树的构建。

各物种间的遗传距离见表 2。由表 2可见:种内遗传距离(0~0.004) 明显低于种间遗传距离(0.025~0.097);种间遗传距离又显著低于属间遗传距离(≥0.143)。种内、种间和种上3个水平的遗传距离区间没有重叠，与Genbank中其他同源序列的遗传距离比较发现也存在以上规律。

利用MEGA3.1软件构建的MP和NJ树基本一致。从NJ树上(图 2)可以看到:用形态学特征鉴定为一个种的样本序列在分子系统树中也首先聚到一起。分子鉴定结果与利用3个主要形态学特征鉴定的结果是一致的。

2.3 切梢小蠹属分类检索表

利用筛选到的3个形态特征建立的切梢小蠹属分类检索表如下:

1 鞘翅斜面第2沟间部有瘤状颗粒…………… 2

鞘翅斜面第2沟间部无瘤状颗粒…………… 4

2 鞘翅瘤状颗粒上的刚毛长而尖，刻点上的刚毛短而钝…………………………………………… 3

鞘翅瘤状颗粒上的刚毛与刻点上的刚毛等长，难区分…………………………………T.puellus

3 前胸背板上刻点分布不均匀，中部刻点稀疏，平滑光亮……………………………横坑切梢小蠹

前胸背板上刻点多，分布均匀…多毛切梢小蠹

4 鞘翅斜面第2沟间部刻点少，呈单列………… 5

鞘翅斜面第2沟间部刻点多，呈2列、3列或无规则…………………………………………… 6

5 鞘翅斜面瘤状颗粒上的刚毛长而尖，约与沟间距等长………………………………纵坑切梢小蠹

鞘翅斜面瘤状颗粒上的刚毛短而钝，约为沟间距的1/2……………………………短毛切梢小蠹

6 鞘翅斜面瘤状颗粒上的刚毛长而尖，约与沟间距等长…………………………………………… 7

鞘翅斜面瘤状颗粒上的刚毛短而钝，约为沟间距的1/2…………………………华山松切梢小蠹

7 欧洲种群，鞘翅斜面第2沟间部刻点无规则排列………………………………………T.destruens

亚洲种群，鞘翅斜面第2沟间部刻点呈双列或“Z”形排列…………………云南纵坑切梢小蠹

3 结论与讨论

本研究建立了一套简单、实用的切梢小蠹属分类鉴定体系。通过对切梢小蠹属800多个样品形态学观察和部分样品的分子生物学鉴定，证明应用3个形态学特征可以准确地将切梢小蠹区分开。3个特征如下:一是鞘翅斜面第2沟间部的瘤状颗粒和刻点分布; 二是鞘翅斜面刚毛长短; 三是前胸背板刻点及刚毛分布。

Faccoli(2006)和Kirkendall等(2008)研究了切梢小蠹属分类特征，主要包括体长、体色、体表刻点和颗粒、触角锤状部、前足胫节、头部、前胸背板、鞘翅斜面、前胃板和雌雄生殖器官等，其中有些特征不稳定或对观察条件要求苛刻，不适合在生产实践中应用; 另外，分类鉴定时使用的特征太多容易使人迷惑，不能实现准确鉴定，所以本研究对这些特征进行了筛选。在观察中发现:体长、体色在不同个体间、个体不同的生长阶段和不同的光源照射条件下变异较大; 前胃板和雌雄生殖器官的观察要求有一定的专业技能; 触角和前足胫节虽存在差异，但要观察到这些差异需要放大300倍以上且对观察光源的要求也比较严格，有时甚至需要借助于电镜观察，这些特征在小蠹分类的实际应用中很难推广。鞘翅斜面及体表刚毛特征的差异在显微镜下放大30倍就可以清楚观察到，非常适合在基层单位推广使用。

值得注意的是在云南纵坑切梢小蠹中左右鞘翅不对称现象非常普遍，可能一边鞘翅刻点为2列而另一边看上去更似1列，这种情况多出现在多种切梢小蠹同域为害区，在云南纵坑切梢小蠹单独为害的地区其鞘翅斜面多为典型2列。因此，在鉴定过程中应详细观察2边鞘翅特征，今后应就该虫2种表型间分化原因做进一步探讨。过去几十年中云南的一些地区切梢小蠹2次大暴发，并扩散至现在的12个州市67个县，一个重要原因就在于没有认清防控对象。从表 1可以看出:云南普遍存在2种或3种切梢小蠹同域危害现象。因此，在云南小蠹防治工作中，首先应利用本研究建立的分类体系对切梢小蠹进行分类鉴定，确定优势种并对其进行有针对性的重点防控。

分子生物学技术在切梢小蠹的分类研究中已有广泛应用(Gallego et al., 2001; Kohlmayr et al., 2002; Duan et al., 2004; Li et al., 2010)。本研究通过对28S rDNA的D2区部分序列的分析发现，切梢小蠹属种下、种间和种上的遗传距离落在3个不重叠的范围内，通过对未知种类与已知种类间遗传距离的比较就可以确定其种类，因此利用28S rDNA的D2区构建的分子分类系统可以实现切梢小蠹属种群分类鉴定。与构建Barcode of Life Data System的初衷相同，该分子鉴定方法可以帮助对形态特征尚把握不准的林业工作者实现小蠹虫种类的准确鉴定。

系统发育树显示6种切梢小蠹形成2大簇群。短毛切梢小蠹和纵坑切梢小蠹最先聚到一起形成一簇，形态学观察可见二者的鞘翅斜面第2沟间部刻点较少，呈单列，短毛切梢小蠹的鞘翅斜面刚毛较短而纵坑切梢小蠹的刚毛较长; 华山松切梢小蠹和云南纵坑切梢小蠹在系统树上也最先聚到一起形成一簇，形态学观察可见二者的斜面第2沟间部刻点较多，呈2列或3列，华山松切梢小蠹的鞘翅斜面刚毛较短而云南纵切梢小蠹的刚毛较长; 这2个簇群聚到一起与T.destruens和横坑切梢小蠹形成2个独立的簇群。形态学观察可见:短毛切梢小蠹、纵坑切梢小蠹、华山松切梢小蠹和云南纵坑切梢小蠹簇群鞘翅斜面第2沟间部均为刻点，而横坑切梢小蠹的第2沟间部却是瘤状颗粒。T.destruens的第2沟间部虽然也分布刻点，但是其仅在欧洲分布，因此，T.destruens与其他来自中国的种类之间遗传距离较大可能是受到地理隔离的影响。从以上分析中可以认为:1) 切梢小蠹属分化过程中受到地理隔离因素的影响; 2) 本研究中采用的表型特征的分化(尤其是鞘翅斜面第2沟间部特征的分化)与28SrDNA D2区的遗传分化具有一致性。

尽管本文涉及的种类较少，但在一定程度上说明了将核糖体28S基因作为遗传标记用于切梢小蠹属系统分类研究是理想的方法之一。如果在下一步的试验中增加切梢小蠹属种类的数量及重复，同时采用多种不同的分子标记，将会更好地阐明切梢小蠹属昆虫的分子进化过程与其形态分化过程的关系。