林业科学  2012, Vol. 48 Issue (2): 75-81   PDF    
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罗晓燕, 侍婷, 蔡斌, 高志红
Luo Xiaoyan, Shi Ting, Cai Bin, Gao Zhihong
核果类果树中microRNAs的生物信息学预测及验证
Identification and Bioinformatics Prediction of Putative microRNAs in Prunus Genus
林业科学, 2012, 48(2): 75-81.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(2): 75-81.

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收稿日期:2011-06-27
修回日期:2011-11-18

作者相关文章

罗晓燕
侍婷
蔡斌
高志红

核果类果树中microRNAs的生物信息学预测及验证
罗晓燕, 侍婷, 蔡斌, 高志红    
南京农业大学园艺学院 南京 210095
摘要: microRNA(miRNAs)是一类非编码小分子RNA,在植物生长发育、新陈代谢以及逆境生理中起重要作用。基于生物信息学的基因搜索和同源搜索,从NCBI数据库中登录的核果类果树的EST和GSS中寻找miRNAs。从核果类果树的107 982条ESTs和48 273条GSSs中搜寻到了11条miRNAs前体序列,编码11条成熟体序列,并预测到19个靶基因,分别编码与生长发育、新陈代谢和转录调节等相关的蛋白。利用miRbase数据库进一步分析表明: 11条miRNAs属于8个microRNA家族,分别来自桃和梅,其大小为20~23bp,其中6条为21bp,而且ppe-miR162a和ppe-miR164f保守性最高。采用poly(A)RT-PCR方法随机对预测的ppe-miR156h,pmu-miR482,ppe-miR399a,ppe-miR171a进行组织表达验证,发现ppe-miR156h在果梅花芽中表达,pmu-miR482,ppe-miR399a,ppe-miR171a在桃叶片中表达。
关键词:microRNA    生物信息学预测    李属    核果类果树    表达序列标签    基因组勘测序列    
Identification and Bioinformatics Prediction of Putative microRNAs in Prunus Genus
Luo Xiaoyan, Shi Ting, Cai Bin, Gao Zhihong    
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University Nanjing 210095
Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are one kind of small RNAs that do not encode any proteins, however play critical role in developmental processes, metabolism and stress responses in plant. Here we present a study of bioinformatics prediction of miRNAs in Prunus using bioinformatics-based gene search based on blasting ESTs and GSSs in NCBI. Eleven precursors coding 11 mature miRNAs were found from 107 982 ESTs and 48 273 GSSs of Prunus, and 19 target genes, which encode proteins involved in developmental processes, metabolism and transcriptional regulation, were predicted. Further analysis of the miRbase database showed that 11 miRNAs belonged to 8 miRNA families from Prunus persica and Prunus mume, and were from 20 to 23 bp in length with 6 miRNAs being 21 bp in length. The miRNAs of ppe-miR162a and ppe-miR164f were the most conservative. In order to prove accuracy of the prediction, ppe-miR156h, pmu-miR482, ppe-miR399a, ppe-miR171 were identified by RT-PCR. The results showed that ppe-miR156h was expressed in flower buds of Prunus mume, and pmu-miR482, ppe-miR399a, and ppe-miR171a were expressed in leaves of Prunus persica.
Key words: microRNA    bioinformatics prediction    Prunus    drupe fruit trees    EST (expressed sequence tag)    GSS (genome survey sequences)    

microRNAs(miRNAs)是一类长度约21~22个核苷酸的非编码RNAs(Ambros,2003; Bartel,2004;Mallory et al., 2004)。在动植物及真菌中,miRNA通过降解靶mRNA或是抑制靶基因的翻译,在转录后基因调控中发挥重要作用(Ambros,2003; Carrington et al., 2003; Hunter et al., 2003; Bartel,2004; Mallory et al., 2004)。植物miRNA最早从拟南芥(Arabidopsis thaliana)小分子文库中获得(Reinhart et al., 2002),主要在转录后水平上负向调控基因表达(Park,2005)。在细胞核中编码miRNA的基因在聚合酶Ⅱ的作用下转录成primiRNA,然后在一种类Dicer酶———DCL1的作用下释放pre-miRNA,DCL1继续作用于pre-miRNA而形成双链miRNA:miRNA*,后者在miRNA甲基转移酶———HEN1的作用下,使3'端最后1个核苷酸发生甲基化修饰。而后,miRNA:miRNA*互补双链在Exportin-5的同源物HST的作用下被转运到细胞质并与RISC结合形成miRNA从而发挥作用(Axtell et al.,2007)。植物miRNA的茎环结构前体在大小及结构特征上都与动物miRNA前体存在较大差异,不易找出共性,但是所有植物的miRNA和miRNA*均来自于相反的茎臂,这使得二者形成了在2个3'端均具有突出末端的复合体。miRNA与发卡结构上的另一条臂包括miRNA*之间存在广泛的碱基配对现象,而且典型的错配碱基数不会超过4个,这也促使一些不对称的突出部分(尤其是在miRNA和miRNA*复合体内部)在大小(通常只有1~2个碱基)及发生频率上降到了最小程度(一般为1次甚至更少)(Meyers et al., 2008)。虽然miRNA是现今生物界最热门的研究课题之一,但是miRNAs的最初发现很偶然(Lai,2003)。目前,许多的miRNAs通过小分子RNA的直接克隆或是生物信息学搜索预测的方法来鉴定(Reinhart et al., 2002; Bonnet et al.,2004; Jones-Rhoades et al., 2004; Lai,2004; Li et al., 2005)。

表达序列标签(expressed sequence tag,EST)是克隆到质粒中表达的基因其cDNA序列的一部分(Adams et al., 1991; Matukumalli et al., 2004)。EST分析对于缺乏基因组序列的物种进行基因发掘是一种经济可行的选择,许多重要的基因就是通过该途径发现的(吕德康等,2009)。近年来,基因组勘测序列(genome survey sequences,GSS)数据库也在不断发展,GSS是基因组DNA克隆的一次性部分测序得到的序列,包括随机的基因组勘测序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通过Exon trapped获得基因组序列、通过Alu PCR获得的序列以及转座子标记(transposon-tagged)序列等,因此也被广泛地应用于植物miRNA的预测中(吕德康等,2009)。随着miRNA家族成员的不断增多,全球成立了miRNA文库,对新的miRNA进行登记和命名。截至目前(2011年5月),在miRNA数据库miRBase(http://www.Mirbase.org/)中注册的miRNA已达16772种。

然而在大多数植物尤其是木本园艺作物中,miRNA基因及其靶标仍然处于未知状态。核果类果树中包括许多重要的果树作物,如桃(Prunus persica)、杏(Prunus armeniaca)、梅(Prunus mume)以及甜樱桃(Prunus avium)等,在这些果树中普遍存在一些表观遗传的现象,如同一株甜樱桃上同时存在畸形雌蕊及正常雌蕊(李勃等,2010)以及梅花器发育不完全的现象均很普遍(王珊等,2008),对果实的产量有较大的影响,降低了经济效益,因此,可以从miRNA调控方面进一步研究这些生命现象的机制。本文利用miRBase中登陆的miRNA,对核果类果树的EST和GSS数据库分析进一步鉴定了一些潜在miRNA基因和它们的靶标。由于ESTs和表达基因来源于真正的基因表达产物,本文的研究分析为新型潜在miRNAs和它们靶基因的鉴定提供了更加充分并可信的论据。使用这种方法,本研究在核果类果树中鉴定了11个新的候选miRNA,以及19个靶基因。

1 材料与方法 1.1 相关数据库的获得

所有已知植物的miRNA序列从miRNA数据库(http://www.mirbase.org/Release16:Sept2010)中下载得到。桃、李(Prunus salicina)、梅等核果类果树的GSS、EST数据库均在美国国家生物技术信息中心GenBank核酸数据库下载得到(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)(January2011)。

1.2 应用的软件

BLAST2.2.24。本地序列比对软件BLAST2.2.24从NCBI的BLAST上下载(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。核酸序列编码蛋白质在BLAST中的BLASTX web界面上进行在线分析。用MFOLD3.5(http://mfold.rna.albany.edu/)在线预测miRNA前体的二级折叠结构(Zuker,2003),并联合使用GSS和EST数据库进行miRNA的搜索。miRNA保守性分析用ClustalX2.1和Mega5.0软件进行分析。

1.3 核果类果树miRNA的生物信息学预测

所有下载的植物miRNA序列,均去除了冗余重复序列。将这些miRNA序列作为探针在核果类果树的EST及GSS库中进行本地BLAST。其中有些EST可能由某个GSS转录而来或是EST和GSS自身存在重复序列或正反互补序列,所以进一步把这些序列与自身进行BLAST,去除重复序列。再通过在线BLASTX分析去除可能编码蛋白的序列。二级折叠结构分析采用软件MFOLD3.5在线进行。预测核果类果树miRNA的整个过程及筛选的标准参照文献(Zhang et al., 2006a; Meyers et al., 2008; 项安玲等,2008; 宋长年等,2010)。

1.4 核果类果树miRNA靶基因预测

预测得到潜在的miRNA后,再将miRNA分别与EST数据库进行BLAST,挑出与miRNA错配数小于4个,并且没有gap存在的序列。再根据一系列的筛选标准,得到的mRNA序列即为相应miRNA的靶基因(Zhang et al., 2006a)。

1.5 试验验证预测的核果类果树的miRNA

通过Wang等(2009)提取小分子RNA的方法,分别从‘龙眼’果梅的花芽中和‘LOVELL’桃的叶片中提取出小分子RNA。通过3'加polyA尾巴(Wang et al., 2009) 对pmu-miR482进行了验证,其他3种miRNA则通过茎环引物法(李贺等,2009)进行试验验证。

2 结果与分析 2.1 核果类果树miRNA的预测

核果类果树的基因组序列除了桃以外,都没有公布。因此,选择了核果类果树在NCBI中登录的EST和GSS序列。最终分别在核果类果树的EST序列和GSS序列中得到2个和9个miRNA,只有miR482来自果梅,其他预测的miRNA均来自桃,没有在核果类果树的其他物种中预测到miRNA。这11个预测的miRNA来源于8个不同的miRNA家族(表 1)。

表 1 核果类果树新预测得到的11个miRNAs及其特性 Tab.1 Eleven novel Prunus microRNAs identified by homolog and their characteristics

在所预测到的核果类果树的miRNA中,成熟miRNA长度为20~24bp,11个为21bp,占多数,这与前人的研究(Mallory et al., 2004)相吻合。miRNA前体长度分布在91~442bp之间,这与其他植物中发现的情况基本一致。与动物60~80bp的前体长度相比,植物的miRNA前体在结构和大小上呈现多样性(图 1)。

图 1 核果类果树新预测miRNA前体茎环结构 Fig.1 Predicted stem loop structures of novel Prunus miRNAs 成熟体以下划线标注。 Mature miRNAs are labeled by underline.
2.2 核果类果树miRNA成熟体序列保守性分析

为了进一步了解miRNAs成熟体的结构特点,将其序列与RNBase中相应的miRNAs家族成员进行保守性分析。结果表明(图 2),核果类果树中预测得到的miRNAs具有较高的保守性,多数miRNAs的5'末端的前4个碱基在各自的家族中都完全相同,表现出了很高的保守性,这与宋长年等(2010)的研究一致。从这8个miRNAs家族的碱基序列情况看,miRNA162和miRNA164的保守程度最高,在比对的不同物种中均含有完全一致的成熟体序列,是高保守miRNAs家族,而同样被报道为植物保守miRNA的miRNA156,出现2个碱基位点的缺失、颠换或转换。同时,miR171,miRNA482,miR399和miR403也只有1~3处碱基位点的差异,均可认为是保守性很高的miRNAs家族。

图 2 核果类果树中10个miRNA家族成员(11个miRNA成熟体)的多样性比较 Fig.2 Alignments of 11 previously known Prunus mature miRNAs
2.3 核果类果树中预测的miRNA在物种中分布的多样性比较

通过与RNBase中相应的miRNA家族成员进行物种分布的比较后,发现核果类果树中预测得到的miRNAs不但具有较高的家族保守性,在物种中的分布也较为广泛。其中与ppe-miR164f高度同源的miR164家族成员在19个不同的物种中存在,ppemiR171a在16个物种中分布,并具有较高的同源性,其次为ppe-miR156,ppe-miR162a,ppe-171b和ppe-miR403c。然而,此次预测中,也发现了一些稀有的miRNAs,如ppe-miR3629只在2个物种中分布。

2.4 核果类果树的miRNA靶基因预测及主要功能分析

在植物中,靶基因与miRNA几乎为碱基完全互补配对。这为生物信息学法预测植物靶基因带来方便。通过预测及筛选,最后找到5个miRNAs的19个miRNA靶基因,分别编码与核果类果树生长发育、新陈代谢、转录调节等相关的蛋白(表 2)。

表 2 核果类果树中新预测的miRNA靶基因 Tab.2 Potential target genes of the identified miRNA family in Prunus
2.5 试验验证预测的核果类果树的miRNA

采用Wang等(2009)的方法分别从‘龙眼’果梅和‘LOVELL’桃的花芽和叶片中提取出小分子RNA,1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,纯化的小分子RNA长度小于500bp(图 3a)。由于miRNA很短,仅有21个核苷酸,而PCR引物的长度一般在20个核苷酸左右,因此无法直接扩增,通过3'加polyA以及茎环引物法,来鉴定预测的miRNAs。4%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,扩增片段长度均在100bp以下,进一步测序后得到了pmu-miR48267bp的扩增序列,而通过茎环引物法扩增的ppe-miR156h,ppe-miR399a和ppe-miR171a产物大小为75bp左右。测序结果表明扩增片段中包含了miRNA的完整序列,这说明预测的pmumiR482,ppe-miR156h,ppe-miR399a和ppe-miR171a确实存在,其中,ppe-miR156h在果梅花芽中表达,pmu-miR482,ppe-miR399a,ppe-miR171a在桃叶片中表达(图 3b)。

图 3 核果类果树新预测的miRNA琼脂糖电泳 Fig.3 Agarose electrophoresis of Prunus novel miRNA a.核果类果树的小分子RNA提取电泳图谱1.‘龙眼’梅花芽; 2.‘LOVELL’桃叶片; M. 2 000 bp DNA ladder。b.核果类果树新预测miRNA RT-PCR鉴定1.梅pmumiR482; 2.桃ppe-miR156h; 3.桃ppe-miR171a; 4.桃ppemiR399a; M. 2 000 bp DNA ladder。 a. Electrophoresis of low molecular weight RNA isolated from Prunus 1. Flower bud of P. mume'Longyan'; 2. Leaf of P.persica'LOVELL'; M. 2 000 bp DNA ladder.b. Detection of Prunus novel miRNA by RT-PCR 1. P. mume pmu-miR482; 2. P. persica ppe-miR156h; 3. P. persica ppemiR171a; 4. P. persica ppe-miR399a; M. 2 000 bp DNA ladder.
3 讨论

植物中miRNAs的保守性是相对的,不同miRNA家族的miRNA碱基序列存在不同程度的水平变异,具有保守性miRNA的家族的miRNA碱基序列的一致性相对较高。生物信息学方法显示,果蝇(Drosophila)(Lai et al., 2003)和人体(Lim et al., 2003) 中预测的蛋白质编码基因中只有1%属于miRNA基因。因此,随着核果类果树基因组信息的日益完善,将会有更多的miRNA家族以及家族成员被发现。

由于受不同miRNAs表达的时空性、ESTs测序所用cDNA文库的组织来源、ESTs数量等因素的影响,不同物种中预测到的miRNA的数量以及家族类型存在差异。目前,已在拟南芥、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、苜蓿(Medicago truncatula)、甘蔗(Saccharum officinarum)、毛果杨(Populus trichocarpa)、马铃薯(Solanum tuberosum)(郭强等,2007)、苔藓(Physcomitrella patens)(http://www.Mirbase.org/)以及园艺植物草莓(Fragaria×ananassa)(李贺等,2009)、苹果(Malus domestica)(Yu et al., 2011)、柑橘(Citrus aestivum)(Song et al., 2009)及葡萄(Vitis vinifera)(Wang et al., 2011)等物种中发现大量的miRNA。但是这些多为模式植物或是基因组测序结束的物种,对于基因信息量较少的植物,进行生物信息学的相关研究还较为困难,如本研究预测的核果类果树中除桃和梅的EST和GSS序列相对较多外,其他物种在NCBI中登录的信息量少之又少,这不仅使miRNA的预测量降低,而且使靶基因预测难以实施。采用先进的测序技术如solexa测序技术等对基因组序列未知的树种进行分析,尤其是对于特殊的生理时期和逆境生理研究具有重要的应用前景。

miRNA及其靶基因控制着生物体内多种生理和代谢过程,植物中,miRNA调控根、茎、叶和花的发育,营养生长向生殖生长的转化以及生物或非生物的应激胁迫反应等(Zhang et al., 2006b)。在预测的11个核果类果树的miRNA中,其中5个调控19个已知靶蛋白分别执行不同的功能。在前人的研究中,miR156家族大多数靶向SBP转录因子(JonesRhoades et al., 2004; Rajagopalan et al., 2006; Moldovan et al., 2010),其中miR156h编码富含脯氨酸蛋白、氨基酸透性酶和咖啡酸氧甲基转移酶,miR156i编码锌指蛋白。咖啡酸氧甲基转移酶是木质素合成过程中的关键酶之一,可使咖啡酸、5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇,参与S-木质素的合成(李波等,2010)。miR399a编码磷酸盐转移酶,与前人报道(Moldovan et al., 2010)一致。miR164f编码NAC结构域蛋白,NAC基因参与植物许多生长发育阶段,如侧根的形成(Xie et al., 2000)、叶片与组织的衰老(Guo et al., 2006)、花原基的形成(Sablowski et al., 1998)、对生物与非生物环境的胁迫反应等(Hegedus et al., 2003),以及果皮衰老(樊晶等,2008)。

综上所述,本研究新鉴定的11条miRNAs,有5条miRNAs靶定19个功能基因,分别编码与核果类果树生长发育、新陈代谢、转录调节等相关的蛋白。由此说明,miRNAs在基因表达中的作用是广泛的。随着更多的miRNAs被发现,及其调节功能研究的逐步深入,miRNAs在基因表达调控中的重要作用将会越来越明显。

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