蜡梅(Chimonanthus praecox)为第四纪冰川末期幸存的孑遗植物, 是我国特有的传统名花和特用经济树种, 以鄂西、川东、陕南为分布中心, 湖北保康、河南鄢陵、重庆、南京等地栽培较多。近年来, 蜡梅在园林绿化和园艺生产中得到广泛应用, 但在品种分类中, 同物异名现象非常普遍, 尚未有统一的分类标准。本研究利用扫描电子显微镜(SEM), 对河南33个蜡梅品种花粉形状、大小、外壁纹饰等进行观测研究, 旨在寻找花粉形态上差异, 为蜡梅品种分类、亲缘关系鉴定和遗传育种等提供孢粉学依据(王伏雄, 1995; 冯立国等, 2007)。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验材料于2008年11月—2009年3月在许昌鄢陵、郑州市人民公园, 郑州市碧沙岗公园及河南农业大学校园采取, 共33个蜡梅品种(表 1)。采样时选取含苞待放的花蕾, 收集花粉。供试品种的鉴定参照赵天榜(1991)的记载。

1.2 试验方法 1.2.1 电镜制样方法

选取即将开放的花蕾, 剥取花药置于硫酸纸上, 室温下在防尘处自然干燥48 h以上, 搜集干燥的花粉置于离心管中。将花粉均匀涂布于粘有双面胶的样品台上, 于IB-5型粒子溅射仪中喷金镀膜, 置日立S-3400扫描电镜下观察。

1.2.2 观察测量方法

选取有代表性的花粉群体、在扫描电镜不同倍数视野下观测花粉赤道面、极面、萌发孔沟和外壁纹饰等特征, 并拍照。测量正常花粉粒极轴长、长赤道轴长(萌发孔沟在中央)、短赤道轴长(萌发孔沟在两侧)、沟宽、穿孔直径、脊宽, 每种花粉至少测量20粒, 求平均值。计算花粉极赤比(P/E)值及体积大小。花粉描述参考Erdtman (1978), 王开法等(1983), 蒋立科(1990)中的名词术语和定义。

1.2.3 数据分析方法

取33个蜡梅品种的花粉作运算单位, 共13个指标(5个定性指标:极面观、长赤道面观、短赤道面观、纹饰类型、粘丝; 8个定量指标:极轴长、短赤道轴长、长赤道轴长、脊宽、穿孔直径、极赤比、花粉大小、沟宽), 定性多态性状按不同形态进行编号为1, 2, …, n, 定量性状取平均值。利用DPS分析软件进行主成分分析, 并采用卡方距离和离差平方和法作聚类分析。

2 结果与分析 2.1 蜡梅花粉形态指标观测结果

8个定量分析指标及5个定性分析指标的扫描电镜观察、测量结果见表 2。

2.2 蜡梅花粉形态特征 2.2.1 花粉极性、类型及大小

供试品种花粉均属等极、左右对称型花粉, 花粉大小中等, 其中‘虎蹄’最大, 为46.11 μm × 32.96 μm × 33.58 μm; ‘口红’最小, 为41.64 μm × 21.97 μm × 25.86 μm极轴长41.64 ~ 52.22 μm, 长赤道轴长24.99 ~ 33.58 μm, 短赤道轴长21.97 ~ 37.70 μm(表 2)。

2.2.2 花粉形状

供试品种花粉以单粒形式存在, 多长球形, 少数为超长球形, 其中‘素心’、‘黄卷波’、‘金冠’、‘金龙紫穴’、‘夕阳墨云’、‘玉彩’、‘金红’和‘金月季’8个品种含有2种形状的花粉, 其余均为长球形; 花粉极面观为椭圆形或近圆形; 长赤道面观椭圆形或长椭圆形; 短赤道面观为近椭圆形、矩形及近矩形(图版Ⅰ-1 ~12)。

2.2.3 花粉外壁纹饰

33个蜡梅品种的花粉外壁纹饰分疣状、蠕虫状、孔穴状及穴状4种类型。其中具有疣状纹饰花粉的供试品种12个; 蠕虫状纹饰品种12个; 孔穴状纹饰品种7个; 仅‘白龙爪’和‘光辉’的花粉外壁具穴状纹饰(图版Ⅰ-13 ~ 16)。

花粉外壁穿孔多为不规则圆形, 不同品种穿孔大小、分布密度及形态特征有一定差异。4种纹饰类型的蜡梅花粉均具不等量的穿孔, 有些品种穿孔较多(如‘乔种’、‘金盘玉蕊’、‘冰紫纹’、‘黄卷波’等); 穿孔直径185.71 ~ 454.44 nm; 脊宽522.17 ~ 856.25 nm。总体看来, 花粉外壁纹饰穿孔直径与脊宽之间无明显的相关性。

2.2.4 花粉萌发孔沟

33个蜡梅品种花粉粒均具2孔沟, 分布于短赤道面的两侧, 沟宽因品种而异, 范围为1.59 ~ 13.39 μm, 沟长接近两级; 部分品种萌发孔沟靠近赤道处有不同程度的凸起, 某些品种在凸起处附有球形颗粒(图版Ⅰ-17 ~ 20)。

2.3 蜡梅花粉形态的主成分分析

对13个花粉形态指标进行主成分分析。由表 4可知:前7个主成分的累计贡献率达到91.23%, 可以代表原始性状的基本信息。第1主成分中特征向量绝对值较大的指标为:体积大小、短赤道轴长、长赤道轴长、沟宽, 主要反映花粉的大小和萌发孔沟特征; 第2主成分:P/E和极轴长, 反映花粉的形状; 第3主成分:粘丝、穿孔直径、脊宽、外壁纹饰类型, 主要反映花粉的外壁纹饰特征。分析结果表明:花粉形态中对蜡梅品种分类影响较大的指标有:外壁纹饰类型、脊宽、短赤道面观、极轴长、长赤道轴长、穿孔直径; 综合重要性状为:外壁纹饰特征、花粉形状及花粉大小。

2.4 蜡梅花粉形态的聚类分析

对33个蜡梅品种的花粉形态进行Q型聚类分析, 结果见图 1:

1) 由等级结合线Lq1=5.295, 可将33个供试蜡梅品种分为2大类群。第一类群包含18个品种, 其中属于蜡梅品种群的有16个, 白花蜡梅品种群2个; 第二类群15个品种, 蜡梅品种群品种12个, 白花蜡梅品种群品种3个。2大类群花粉形态在极面观和长赤道面观上有明显区别, 除第一类群中‘朱心’花粉极面观为近圆形外, 第一、二类群分别为椭圆形和近圆形; 第一类群长赤道面观多为长椭圆形, 第二类群均为椭圆形。

2) 在等级结合线Lq2=4.051处, 蜡梅品种可分为3大类:第一大类5个; 第二大类13个; 第三大类即为第二类群所有品种。其中第一大类5个品种的花粉脊宽、萌发沟宽及短赤道轴长较第二大类品种大。

3) 在等级结合线Lq3=2.807处, 33个蜡梅品种可分为5类。其中第二大类又被划分为2类, 即第二类, 第三类(第一类为等级结合线Lq2处的第一大类), 第三类蜡梅品种的花粉大小和P/E值普遍大于第二类; 第二类群中的15个品种又分为2类, 即第四类, 第五类, 两类最大的差异表现在脊宽及穿孔直径上, 第四类8个品种的脊宽和穿孔直径较小。

3 讨论 3.1 样品选取和处理方法对观察结果的影响

张若蕙等(1989)报道蜡梅属植物花粉有穴状、蠕虫状和疣状3种纹饰类型, 本研究发现不少品种具孔穴状纹饰, 且仅‘白龙爪’和‘光辉’2个品种为穴状纹饰。笔者认为这是由于品种选取的不同而致, 因此, 今后的研究应扩大样品量以使观察结果更全面。

徐柏森等(2007)认为不同种类植物花粉的生物性能差别较大, 在进行电镜观察时需采取不同的制样方法。本研究经过预试验比较了自然通风干燥和FAA固定液保存2种花粉处理方法对花粉形态的影响。对照新鲜花粉, 发现通过FAA固定液处理后的花粉膨胀成近球形, 显著区别于新鲜花粉。因此本研究采用了自然干燥法, 这与王文莉等(2005), 郑林等(2008)的方法一致, 但有别于陈菁瑛等(2003)的研究。

3.2 蜡梅品种分类与花粉形态的关系

分析上述聚类结果, 结合蜡梅花部形态特征, 参照己有的形态学分类研究成果(杜灵娟, 2006; 赵冰等, 2007; 芦建国等, 2008), 发现蜡梅花粉形态分类与传统外部形态分类结果不一致, 不同品种群的品种也因花粉性状相似而较早聚合。说明蜡梅花粉性状与其外部形态分类依据(如花型、花色、内被片颜色、花期等)无直接的相关性。这与前人对梅花(Prunus mume)(康素红等, 1997)、桂花(Osmanthus fragrans)(蔡丹, 2006; 臧德奎, 2004; 赵小兰等, 1999)、平阴玫瑰(Rosa rugosa)(王文莉等, 2005)、杜鹃(Rhododendren)(周兰英等, 2008)等花卉的孢粉学分类研究结果相符。

Kolon(1982)指出:当分类单元为科、属、种时, 花粉的大小和形状差异较大, 对于物种分类、演化研究及亲缘关系分析时具有一定的参考价值; 但品种间这些特征的差异较小。李林初(1990)、Ning等(1993)分别对不同属间的蜡梅花粉进行观察和研究表明:蜡梅不同属间花粉差异明显。但Nicely (1965)对蜡梅科植物的花粉形态的研究指出其在属间或种间具分类价值不大, 并认为花粉形态在同一花药里都是可变的。

本研究认为花粉形态差异(特别是在花粉外壁纹饰、花粉形状及大小方面表现出的差异), 可作为蜡梅属级及以上类别的划分依据, 也可作为品种划分的参考依据之一, 但不主张其作为品种分类和亲缘关系鉴定的唯一依据。

3.3 蜡梅品种花粉形态学研究的意义

本研究所观察的33个蜡梅品种在花粉形态特征方面表现出较高的一致性, 在一定程度上支持了传统分类的种级分类单位的共同特征; 同时, 供试样品在许多细微形态特征上也表现出了品种的特异性, 如花粉大小、极面观、萌发沟宽及花粉外壁纹饰类型等, 说明蜡梅种内有较丰富的遗传多样性, 因此可通过杂交育种、组织培养、遗传转化等技术进一步创新和丰富其种质资源。