林业科学  2011, Vol. 47 Issue (11): 204-207   PDF    
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李晓娟, 骆有庆, 阎雄飞, 田桂芳, 年寅杰, 孙红
Li Xiaojuan, Luo Youqing, Yan Xiongfei, Tian Guifang, Nian Yinjie, Sun Hong
光肩星天牛幼虫纤维素酶活性的变化趋势
Cellulase in Larvae of Asian Longhorn Beetle Anoplophora glabripennis
林业科学, 2011, 47(11): 204-207.
Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(11): 204-207.

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收稿日期:2010-04-18
修回日期:2010-09-04

作者相关文章

李晓娟
骆有庆
阎雄飞
田桂芳
年寅杰
孙红

光肩星天牛幼虫纤维素酶活性的变化趋势
李晓娟1,2, 骆有庆1, 阎雄飞3, 田桂芳4, 年寅杰4, 孙红4    
1. 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室 北京 100083;
2. 安徽省林业科学研究院森林保护研究所 合肥 230031;
3. 榆林学院生命科学学院 榆林 719000;
4. 宁夏吴忠市林业局 吴忠 751100
关键词:酶活性    寄主植物    人工饲料    龄期    日龄    
Cellulase in Larvae of Asian Longhorn Beetle Anoplophora glabripennis
Li Xiaojuan1,2, Luo Youqing1 , Yan Xiongfei3, Tian Guifang4, Nian Yinjie4, Sun Hong4    
1. Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education, Beijing Forestry University Beijing 100083;
2. Research Institute of Forest Conservation, Anhui Academy of Forestry Hefei 230031;
3. College of Life Science, Yulin University Yulin 719000;
4. Forest Bureau of Wuzhong of Ningxia Wuzhong 751100
Abstract: Asian longhorn beetle larvae were fed on host plants and artificial diet to investigate the variation of cellulase, and the activity of exoglucanase and β-glucosidase were measured. The results showed that larvae fed on host tree under natural growth situation had a significant reduction in both endoglucanase and β-glucosidase activities. The activity of endoglucanase in the first and second instars was higher than the followed three instars, and the activities of β-glucosidase in the former three instars are higher than the followed two instars. This trend also occurred in the larvae fed on artificial diet. The activity of endoglucanase in the 10, 20 and 30 days of age larvae was higher than that in the 80, 100 and 120 days of age larvae, and the activities of β-glucosidase reached a peak in the 60 days of age larvae, higher than the 80, 100 and 120 days of age larvae. Therefore it is suggested that ecological control measures related to cellulase inhibitor should be carried out on the first two instars larvae. According to its biological characteristics, the best time for controlling through inhibiting the activity of cellulase would be from September to November.
Key words: enzyme activity    host tree    artificial diet    instars, days of age    

光肩星天牛(Anoplophora glabripennis) (ALB, Asian longhorn beetle)属鞘翅目、天牛科、沟胫天牛亚科、星天牛属,是我国重要林木蛀干害虫(萧刚柔,1992)。中国东部光肩星天牛分布区位于100°—127°E、21°—43°N(阎俊杰,1985);该虫现已在美国伊利诺斯州的芝加哥市、纽约州的纽约市和长岛以及新泽西州,加拿大的多伦多和安大略建立低密度种群,奥地利、德国乃至法国亦有光肩星天牛的报道(Hajek,2007)。在我国,其主要寄主树种为杨(Populus)、柳(Salix)、榆(Ulmus)、槭(Acer)等(骆有庆等,1999)。在北美洲,光肩星天牛幼虫的寄生树种至少有12属18种(Morewood et al., 2005)。光肩星天牛幼虫蛀干危害,幼虫孵出后, 开始取食腐坏的韧皮部,2龄幼虫开始向旁侧取食健康树皮和木质部,3龄末或4龄幼虫在树皮下环食木质部表面,然后开始蛀入木质部危害;成虫羽化后还未性成熟,仍需补充营养9~15天,主要取食叶柄、叶片及小枝皮层(骆有庆等,1999Smith et al., 2002Keena,2002Hajek et al., 2007)。

天牛危害树木,主要通过消化其中纤维素获得养分,而纤维素酶是其肠道内消化纤维素的重要消化酶类(索风梅等,2004)。研究光肩星天牛纤维素酶在其肠道内的分布,对阐明其消化生理、寻找防治新方法、开发利用纤维素酶的昆虫资源,乃至进一步明确光肩星天牛纤维素酶的来源,都具有重要的意义(殷幼平等,1996)。

有关天牛体内纤维素酶的研究,主要集中在对老熟幼虫的研究(殷幼平等,1996;Chen et al., 2000;索风梅等,2004),而对于不同龄期天牛幼虫体内纤维素酶的变化趋势并不明确,不利于今后基于纤维素酶抑制剂的生态防治方法的实施。

Geib等(2005)曾报道,取食人工饲料的光肩星天牛幼虫体内Cx酶和β-葡萄糖苷酶活性均有显著下降,是由于光肩星天牛幼虫以人工饲料为食,而人工饲料中的单糖含量比较高;但并没有与取食寄主植物的光肩星天牛幼虫作比较,取食寄主植物的幼虫体内纤维素酶活性的变化规律也不明确。所以光肩星天牛幼虫随着虫体的不断生长,其体内纤维素酶活性呈下降趋势,究竟是不是因为取食了人工饲料,尚无法定论。

鉴于此,本文选取寄主植物中不同龄期光肩星天牛幼虫,以及人工饲料喂养的不同日龄光肩星天牛幼虫为研究对象,以期明确自然生长与取食人工饲料2种食物条件下,光肩星天牛幼虫体内纤维素酶活性的变化趋势,为今后利用纤维素酶抑制剂防治光肩星天牛提供有力指导。

1 材料与方法 1.1 虫体来源

1) 取食寄主植物幼虫来源  2008年10月在宁夏吴忠市砍伐合作杨(Populus simonii×Populus pyramidalis ‘Opera 8277’)虫害木,截成段,用劈木机劈开木段,获取不同龄期幼虫,解剖镜下测微尺测量头壳宽度,确定幼虫龄期大小。光肩星天牛幼虫头壳宽度及其对应的龄期见表 1(贺萍等,1992)。

表 1 光肩星天牛幼虫头壳宽及其对应龄期 Tab.1 Head width of ALB larvae and corresponding instars

2) 取食人工饲料幼虫来源  光肩星天牛卵的采集: 2009年9月在北京大兴区垡上村,以旱柳(Salix matsudana)上光肩星天牛刻槽为线索,挖取光肩星天牛卵粒。

饲料的配制:饲料的配制方法参考文献(贺萍等,1992赵军等,1992a1992bKeena,2005)。

采集复叶槭(A. negundo)枝条,洗净,-70 ℃冷冻24 h,用植物粉碎机将其制成粉末。饲料各成分配比是:复叶槭粉末90 g,琼脂22.5 g,酵母粉10 g,山梨酸1.5 g,对羟基苯甲酸甲酯1.5 g,抗坏血酸1.5 g,蒸馏水520 mL。

加热琼脂直至完全溶解,再加其他组分,均匀搅拌,分装灭菌后备用。

幼虫的饲养:将光肩星天牛卵消毒,70%乙醇冲洗1次,1%甲醛冲洗3次,灭菌水冲洗4次;28 ℃恒温培养,待其孵化,在无菌条件下放入人工饲料中,每隔10天更换饲料,待饲养到实验所需各日龄后取出,检测其纤维素酶活性。

1.2 试剂来源

羧甲基纤维素(CMC),sigma分装,北京鼎国生物技术有限责任公司生产;水杨素(Salicin),美国Alfa Aesar公司生产;3,5-二硝基水杨酸,北京笃信精细制剂厂生产;其他试剂均为分析纯。

1.3 纤维素酶液的制备

将所取光肩星天牛幼虫称体质量后,-70 ℃冷冻杀死,用于纤维素酶活性检测。取天牛幼虫1头4 ℃解冻4 h,冰上解剖,取出肠道,立即分别放入盛有2 mL冰冷乙酸-乙酸钠(pH5.2,0.1 mol·L-1)缓冲液的灭菌研钵,加入0.5 g石英砂,在冰上研磨成匀浆,使其释放消化酶;将匀浆液于4 ℃离心20 min(12 000 r·min-1),上清液即为原酶液,分装后置于-30 ℃冰箱中保存备用。取食寄主植物各龄期以及取食人工饲料各日龄的幼虫,1头为1次处理,重复5次。

1.4 纤维素酶活性的测定

原酶液中各纤维素酶组分活性的测定采用DNS法,Cx酶的测定用1%羧甲基纤维素(CMC)作底物,β-葡萄糖苷酶的测定用1%水杨素为底物。底物均用乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2,0.1 mol·L-1)配制。

100 μL原酶液与200 μL上述底物充分混匀,40 ℃水浴中温育1 h后,加入DNS显色剂300 μL中止反应,混匀后立即沸水浴显色5 min,室温冷却,稀释5倍后于540 nm处测OD值,每处理重复3次,取平均值,同时设空白对照。以试验条件下单位虫体质量(g)单位时间(h)酶促反应生成的还原糖(葡萄糖)量(μmol)计算酶活性,即: μmol(葡萄糖)· g-1(FW) h-1(殷幼平等,1996Chen et al., 2002杨天赐等,2003索风梅等,2004)。

1.5 数据分析

使用软件SPSS13.0,采用单因素方差分析(ANOVA),P < 0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析 2.1 取食寄主植物不同龄期光肩星天牛幼虫纤维素酶活性

Cx酶活性如图 1所示。1, 2龄幼虫Cx酶活性显著高于3, 4, 5龄幼虫,1龄幼虫与2龄幼虫之间、3龄幼虫和4龄幼虫之间、4龄幼虫和5龄幼虫之间Cx酶活性均无显著性差异。1龄幼虫Cx酶活性为42.05 μmol· g-1 h-1,5龄幼虫Cx酶活性为1.38 μmol· g-1 h-1,1龄幼虫Cx酶活性大小是5龄幼虫的30多倍。

图 1 取食寄主植物不同龄期光肩星天牛幼虫Cx酶活性 Figure 1 Cx-cellulase activities of ALB larvae of different instars fed on host tree 不同字母表示差异达到显著水平(ANOVA检验,P < 0.05)。 Different letter means the significant difference (P < 0.05).下同The same below.

取食寄主植物不同龄期光肩星天牛幼虫β-葡萄糖苷酶活性如图 2所示:1, 2, 3龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性显著高于4, 5龄幼虫,1, 2龄幼虫和3龄幼虫之间,4龄幼虫和5龄幼虫之间β-葡萄糖苷酶活性均无显著性差异。1龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性为15.1 μmol· g-1 h-1,5龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性为3.02 μmol· g-1 h-1,1龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性是5龄幼虫的5倍多。

图 2 取食寄主植物不同龄期光肩星天牛幼虫β-葡萄糖苷酶活性 Figure 2 β-glucosidase activities of ALB larvae of different instars fed on host tree
2.2 取食人工饲料不同日龄光肩星天牛幼虫纤维素酶活性

取食人工饲料不同日龄光肩星天牛幼虫Cx酶活性如图 3所示。10,20,30日龄幼虫Cx酶活性显著高于80,100,120日龄幼虫;10日龄幼虫Cx酶活性高于其他所有日龄幼虫;20,30,40,50日龄幼虫和60日龄幼虫之间Cx酶活性无显著性差异;80,100日龄幼虫和120日龄幼虫之间Cx酶活性无显著性差异。10日龄幼虫Cx酶活性为37.17 μmol· g-1 h-1,80日龄幼虫Cx酶活性为1.53 μmol· g-1 h-1,10日龄幼虫Cx酶活性是80日龄幼虫的20多倍。

图 3 取食人工饲料光肩星天牛幼虫Cx酶活性 Figure 3 Cx-cellulase activities of ALB larvae fed on artificial diet

取食人工饲料不同日龄光肩星天牛幼虫β-葡萄糖苷酶活性结果如图 4所示。β-葡萄糖苷酶活性在60日龄幼虫达到最高峰,显著高于80,100,120日龄幼虫;10,20,30,40日龄幼虫和50日龄幼虫之间β-葡萄糖苷酶活性无显著性差异;80,100日龄幼虫和120日龄幼虫之间无显著性差异。60日龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性为13.55 μmol· g-1 h-1,80日龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性为2.36 μmol· g-1 h-1,60日龄幼虫β-葡萄糖苷酶活性大小是80日龄幼虫的5倍多。

图 4 取食人工饲料光肩星天牛幼虫β-葡萄糖苷酶活性 Figure 4 β-glucosidase activities of ALB larvae fed on artificial diet
3 讨论

Geib等(2005)以取食人工饲料的光肩星天牛幼虫为试验材料,发现其体内Cx酶和β-葡萄糖苷酶活性均有显著性下降,他们认为:光肩星天牛幼虫体内纤维素酶活性的下降,是由于光肩星天牛幼虫以人工饲料为食,因为人工饲料中的单糖含量比较高。而事实上,在取食寄主植物和人工饲料光肩星天牛体内,其纤维素酶活性均呈现下降趋势。笔者认为:光肩星天牛幼虫随着虫体的生长,其体内纤维素酶活性逐渐下降的原因,并不一定是由于取食人工饲料,这有可能是由于老熟幼虫相对取食量降低而导致,也有可能是由于随着天牛幼虫的生长,其体内的纤维素酶活性到达一个稳定的水平,但体质量却不断增加,从而使相对酶活性降低。

根据光肩星天牛的生物学特性,成虫一般于5月开始出现,6月下旬至7月上旬和8月上旬为羽化盛期,成虫补充营养后2~3天即可交尾,交尾后雌虫便可产卵,卵期一般为10天左右(骆有庆等,1999)。光肩星天牛幼龄幼虫主要出现在9—11月,主要在树木韧皮部危害,因此基于纤维素酶抑制剂的生态防治方法适于9—11月开展。

参考文献(References)
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