林业科学  2011, Vol. 47 Issue (10): 98-103   PDF    
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黄麟, 徐旭凌, 李超, 叶建仁, 吴小芹
Huang Lin, Xu Xuling, Li Chao, Ye Jianren, Wu Xiaoqin
松材线虫虫体特异表达cDNA文库的构建与分析
cDNA Library Construction and Analysis of Differentially Expressed in Mixed Stage Nematode of Bursaphelenchus xylophilus
林业科学, 2011, 47(10): 98-103.
Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(10): 98-103.

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收稿日期:2010-10-15
修回日期:2011-05-12

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黄麟
徐旭凌
李超
叶建仁
吴小芹

松材线虫虫体特异表达cDNA文库的构建与分析
黄麟, 徐旭凌, 李超, 叶建仁, 吴小芹    
南京林业大学江苏省有害生物入侵与控制重点实验室 南京 210037
摘要: 松材线虫取食和致病相关基因的鉴定是揭示松材线虫病致病机制的重要研究内容。以松材线虫混合虫体为测试方,线虫卵为驱动方,构建二者差减cDNA文库。文库测序结果经序列拼接、功能注释,共获得松材线虫虫体特异表达的有效EST序列354个,拼接后获得34个重叠群,其中15个重叠群获得明确的功能注释,其中MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶、β-1, 4内切葡聚糖酶、锌指家族蛋白有较高的同源性,这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。RT-PCR分析验证了所获得的差减cDNA的代表性。
关键词:松材线虫    混合虫体    致病相关基因    抑制差减杂交    
cDNA Library Construction and Analysis of Differentially Expressed in Mixed Stage Nematode of Bursaphelenchus xylophilus
Huang Lin, Xu Xuling, Li Chao, Ye Jianren , Wu Xiaoqin    
Jiangsu Key Laboratory for Prevention and Management of Invasion Species, Nanjing Forestry University Nanjing 210037
Abstract: Identification of nematode feeding and pathogenicity-related genes of Bursaphelenchus xylophilus was critical to reveal the molecular mechanism of the Pine Wood Disease (PWD). In this study, a suppression subtractive hybridization (SSH) cDNA library was constructed from the mixed stage nematode cDNA of B. xylophilus isolate AN19#F1, which was driven by the egg cDNA of AN19#F1. A total of 34 contigs generated from 354 ESTs after cDNA sequencing were obtained. Among them 15 contigs were functionally annotated. Contigs, MixC12, MixC25 and MixC33 had high homology with Peroxidase, Beta-1, 4-endoglucanase, zinc finger family protein in the database, respectively. The genes were considered closely related to the feeding and pathogenicity processes. RT-PCR analysis confirmed the respective of the SSH cDNAs.
Key words: Bursaphelenchus xylophilus    mixed stage nematode    pathogenicity-related gene    suppression subtractive hybridization    

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,由于机制尚未十分清楚,致使该病的防治技术研究进展缓慢,疫情在我国呈不断扩散蔓延之势(张星耀等,2003徐华潮等,2010谈家金等,2003潘宏阳等,2009)。松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)取食和致病性相关基因的研究是揭示该病致病机制的关键。松材线虫的发育阶段从形态特征上,可以明显区分为卵、J2、J3、J4幼虫和雌雄成虫5个阶段,从J2幼虫开始具备了取食树木细胞和真菌菌丝体的特点(刘维志,2000瞿红叶等,2009)。与根结线虫(Meloidogyne spp.)和胞囊线虫(Heterodera spp.)等只能从寄主植物活体细胞摄取营养不同,松材线虫不仅能够取食树木细胞,也能取食部分真菌培养物(杨宝君等,2003瞿红叶等,2009),这为松材线虫的扩繁和线虫样本的收集提供了方便。为了分离松材线虫取食和致病相关基因,本试验以松材线虫混合虫体作为测试方,以松材线虫卵为驱动方,构建二者的抑制差减cDNA文库,并对文库测序获得的EST进行分析,以期筛选获得部分松材线虫取食和致病相关基因。

1 材料与方法 1.1 线虫材料

松材线虫AN19#F1家系虫株由南京林业大学森林病理学实验室保存。线虫接种在灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的培养介质上进行扩繁,线虫收集后经0.2%的硫酸链霉素消毒30 min,灭菌生理盐水洗涤3遍。将经表面消毒后的线虫置于新鲜的灰葡萄孢培养基上25 ℃恒温培养,待线虫取食完全后,采用Baermann漏斗法收集线虫。并按Kikuchi等(2004)的方法洗涤线虫,去除残留的灰葡萄孢菌丝,收集获得线虫混合虫体。

为了收集线虫卵,洗涤后的线虫放入直径为9 cm的无菌玻璃培养皿中,25 ℃恒温放置过夜待线虫产卵。线虫卵壁的粘性物质使得卵很容易粘附在培养皿底部,而线虫则悬浮在水中,此时倒去线虫悬浮液并用无菌水冲洗3次,在显微镜下挑弃培养皿底部残余的线虫后,加入少量纯水,并用柔软的毛刷刷下线虫卵,悬浮在水中的卵通过离心收集后保存于RNAlater中,-20 ℃长期保存备用。多次收集合并后的线虫卵用于RNA提取。

1.2 试剂

RNA reagent购自Invitrogen公司;消减文库试剂盒(BD PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit)购自Clontech公司;pGEM-T Vector购自Promega公司;DNA Polymerase和内切酶等购自TaKaRa公司;DNA Marker V购自Transgen公司;其余试剂均为分析纯。

1.3 RNA制备

将提取总RNA所用的研钵和塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高温灭菌处理40 min,以除去RNase,放置备用。所用溶液均用0.1%的DEPC水配制。总RNA的提取按照Trizol试剂使用说明书进行,获得的提纯RNA经DNase Ⅰ处理去除残留DNA。

1.4 抑制消减杂交

抑制消减杂交根据Clontech公司BD PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit说明书进行。

1.5 文库测序与序列分析

抑制消减产物经2轮PCR富集差异表达cDNA,PCR产物经纯化后连接pGEM-T载体,转化JM109,获得差减cDNA文库。随机挑取阳性克隆送上海英骏公司进行测序。对获得的测序结果经CHROME软件去除载体序列,获得EST序列。并采用Seqman Ⅱ软件对获得的EST进行序列拼接,获得重叠群(Contigs)。所有Contigs运用BLASTx程序在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)非冗余蛋白数据库中进行比对分析,E-value域值设置为E-4。

1.6 差异表达基因的半定量RT-PCR

根据测序及序列比对结果,选取部分Contigs,设计引物,以看家基因Actin为参照进行RT-PCR分析,每个试验独立重复3次。试验中所用引物及序列见表 1

表 1 半定量RT-PCR所用引物 Tab.1 Primers used in the semi-quantitative RT-PCR
2 结果与分析 2.1 dscDNA合成与RsaⅠ酶切效率分析

总RNA在反转录酶的作用下反转录合成dscDNA,cDNA片段主要集中在0.5~2.5 kb间,经Rsa Ⅰ酶切生成平端的cDNA片断用于后续的接头连接反应,Rsa Ⅰ酶切后的cDNA片段集中在0.2~1.0 kb(图 1)。经2%琼脂糖凝胶电泳检测表明获得了较高的酶切效率。

图 1 dscDNA的Rsa Ⅰ酶切 Figure 1 DscDNA digested by Rsa
2.2 接头连接效率分析

dscDNA经Rsa Ⅰ酶切消化后,分别连接不同的接头Adaptor1和Adaptor 2R。以看家基因Actin特异引物ACTINR与接头引物PCR Primer 1配对进行PCR,获得的扩增产物与用Actin基因上、下游引物获得的扩增产物的比较结果来评价接头的连接效率(图 2)。电泳结果表明接头的连接效率达到了25%以上的试验要求。

图 2 看家基因Actin cDNA片段接头连接效率 Figure 2 Efficiency assessment of Actin cDNA fragment ligated by adaptors 1, 2:连接Adaptor 1的cDNA为模板,PCR Primer 1/ACTINR、ACTINF/ACTINR为引物的PCR产物。PCR products amplified by primer set Primer 1/ACTINR and ACTINF/ACTINR respectively with the template of house-keeping gene Actin cDNA ligated by Adaptor 1. 3, 4:连接Adaptor 2R的cDNA为模板,PCR Primer 1/ACTINR、ACTINF/ACTINR为引物的PCR产物。PCR products amplified by primer set Primer 1/ACTINR and ACTINF/ACTINR respectively with the template Actin cDNA fragment ligated by Adaptor 2R.
2.3 PCR扩增

消减杂交产物经2次PCR扣除背景、富集差异表达cDNA,结果如图 3所示。与未消减对照相比,经过消减后的cDNA明显富集,获得的差异表达cDNA片段主要集中在250~750 bp之间。

图 3 虫体cDNA的巢式PCR扩增产物 Figure 3 Nested PCR product of the subtracted cDNAs of nematodes Musp1:未消减cDNA第1轮PCR;Musp2:未消减cDNA第2轮PCR;Musp1, Musp2. 1st round and 2nd round PCR products of unsubtrated cDNA respectively. MsP1:消减cDNA第1轮PCR;Msp2:消减cDNA第2轮PCR。MsP1, MsP2. 1st round and 2nd round PCR products of subtrated cDNA respectively.
2.4 差减效率分析

抑制消减过程中的消减效率直接关系到消减产物的阳性率。为了分析消减效率,以消减后第2轮PCR产物及未消减对照的第2轮PCR产物为模板,扩增看家基因Actin的cDNA片段。分别取18,23,28和33个循环的PCR产物进行电泳分析。结果如图 4所示:消减的模板在28个循环后才隐约出现条带,而未消减的模板在23个循环就开始出现扩增产物,表明经过消减杂交后背景被明显降低。

图 4 消减效率的PCR评价 Figure 4 Evaluation of the subtraction efficiency
2.5 文库重组子的鉴定

构建好的消减cDNA文库经蓝白斑筛选,菌液PCR用Nested Primer 1和Nested Primer 2R为引物,所扩增的片段介于200~700 bp之间(图 5)。由于用于构建的消减文库的cDNA经4个碱基的识别酶Rsa Ⅰ切割,理论上每44=256个碱基就有1个酶切位点,插入片段大小和理论预计结果相符。

图 5 消减文库的PCR鉴定 Figure 5 Identification of positive clones of SSH cDNA library by PCR method M:标准分子量DNA marker; 1-16:随机挑取克隆的PCR产物PCR products from randomly selected clones.
2.6 抑制消减cDNA文库的测序与分析

松材线虫虫体特异表达cDNA文库测序共获得354个有效EST,拼接后获得34个Contigs,长度100~250 bp之间的Contigs最多,占60%以上,平均长度为259 bp。由于cDNA克隆的挑选测序是随机的,因此,1个Contig所包含的EST个数往往也反映同一个cDNA的表达丰度或表达频率。从基因的表达丰度来看,松材线虫虫体特异性表达丰度最高的2个EST被重复测序了78次和62次,占EST总数的22%和17.6%,而表达丰度较低的单次测序的EST有11个,占EST总数的3.1%。

Blastx结果表明:松材线虫虫体特异表达的34个EST Contigs中,15个Contigs有明确的功能注释,占Contigs总数的44%,分别与数据库中马来丝虫(Brugia malayi)、猪蛔虫(Ascaris suum)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)等动物寄生线虫和自由生活线虫蛋白有显著的同源性(表 2)。其中,rRNA基因启动子结合蛋白(rRNA promoter binding protein)、细胞色素P450(Cytochrome P450)、过氧化物酶家族同源蛋白(Peroxidase homolog family member)、衰老相关蛋白(Senescence-associated protein)、cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase)等基因为高丰度表达基因。MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶(Peroxidase)、β-1, 4内切葡聚糖酶(Beta-1, 4-endoglucanase)、锌指家族蛋白(Zinc finger family protein)有较高的同源性,这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。

表 2 松材线虫虫体特异表达的EST Contigs功能注释结果 Tab.2 The results of EST contigs homology comparison of the mixed stage B.xylophilus
2.7 差异表达基因的RT-PCR结果

以看家基因Actin为对照对获得的差异表达的Contigs设计引物进行RT-PCR分析,如图 6所示。结果表明:通过抑制差减杂交获得的差异表达的Contigs具有较高的代表性,其中MiC12过氧化物酶同源基因、MiC25纤维素酶同源基因和MiC33锌指蛋白在混合阶段的虫体中都高量表达,而在卵中的表达量微弱,表明差减文库具有较好的代表性。

图 6 部分差异表达基因的RT-PCR分析 Figure 6 Semi-quantitative RT-PCR analysis of differently expressed genes Actin:看家基因对照Positive control Actin gene; Targets:目标基因Target genes.每幅图左边条带为虫体表达水平,右侧为虫卵表达水平。The left band means the nematode expression, and the right is the egg expression.
3 讨论

抑制消减杂交技术是Diatchenko等(1996)建立在基于抑制PCR基础上的一种分离差异表达基因技术,是目前快速鉴定差异表达基因的最有效方法之一。与以往种种差减杂交技术相比,SSH技术的优势主要表现在以下几个方面:1)不同丰度的转录子趋于一致,克服了因拷贝数目不同对试验结果的影响,提高了差减的灵敏度; 2)仅需1轮差减杂交即可对差异表达的cDNA分子达到1 000多倍的富集; 3)假阳性率低; 2步杂交和2次PCR可保证其克隆有94%为真阳性(Siebert et al., 1995); 4)速度快,效率高。一次SSH可以同时分离到几十甚至几百个差异表达的基因(von Stein et al., 1997)。SSH技术也存在以下缺点:1)该技术需要几微克的mRNA; 2)由于差减库中的cDNA已经限制酶消化,不再是全长cDNA,对后期基因的克隆等带来困难;3)不能同时进行数个组织/细胞间或不同处理间的比较;4)接头与cDNA连接效率也会影响到获得的消减序列的代表性。SSH自1996年报道以来,由于其试验方法具有优越性,被迅速应用医学、生物学的各个领域,并与其他的分子生物学技术,如DNA芯片技术相结合,克隆了许多相关的差异表达基因(张轶文等,2005)。

在植物线虫致病性相关基因的克隆方面,SSH技术也已经被广泛应用。Gao等(2001)构建了大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)食道腺和肠的消减杂交文库,获得了23个食道腺特异表达的独立基因,其中10个基因是含有信号肽的分泌蛋白基因,这些基因被推测在大豆孢囊线虫的致病过程中发挥重要作用。与根结线虫(Meloidogyne spp.)和胞囊线虫(Heterodera spp.)等植物学线虫取食特性不同,松材线虫具有能在人工培养基上取食、繁殖的特性,因此,给获取文库构建材料提供了方便。但松材线虫具有世代重叠的特征,因此,在人工条件下很难获得生长发育完全一致的虫体又给研究材料带来了较大的背景干扰。松材线虫的1龄幼虫是在虫卵内发育完成的,从卵孵化出的2龄幼虫开始取食,直到完成整个生活史。因此,线虫卵被认为是松材线虫不具有取食能力的虫态。松材线虫卵与混合虫体消减文库的构建为探讨松材线虫发育与致病性的可能分子机制打下了基础。

氧化物酶是植物线虫破坏寄主植物防卫反应的重要活性蛋白。有研究表明:马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)真皮层能够分泌一种过氧化物酶家族之一的硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase)来破坏寄主植物的抵御反应,生物学活性分析表明该蛋白特异性代谢过氧化氢,因此推测该蛋白可能具有保护线虫抵御植物防卫的作用(Robertson et al., 2000)。谷胱甘肽氧化物酶是另一类生物消除过氧化氢、抵御氧胁迫的主要方式。有研究表明:谷胱甘肽氧化物酶其作用方式可能有别于硫氧还蛋白过氧化物酶作用于过氧化氢,而是作用于植物体内另一个重要的植物防卫信号——脂肪酸过氧化物(Tang et al., 1995;Tripp et al., 1998)。MiC12片段由于经过SSH杂交前的酶切,片段较短,没有能够注释到具体那一类蛋白,因此关于该基因的功能研究将依赖于该基因的全长克隆。在纤维素酶在植物线虫中普遍存在,是一类与植物线虫侵染、寄生密切相关的一类基因,是植物线虫侵染寄主植物发挥重要作用的一类活性蛋白(Kikuchi et al., 2005Smant et al., 1998Rosso et al., 1999Goellner et al., 2000Gao et al., 2002)。纤维素酶在松材线虫致病过程中发挥重要作用,目前已有研究对松材线虫分泌的纤维素酶进行了纯化和性质分析(马海宾等,2009张锴等,2010)。有研究表明:松材线虫中至少存在有3个基因构成的纤维素酶基因家族(Kikuchi et al., 2005),但MiC25是否属于它们中的一类或是其他的新家族还有待于该基因的全长cDNA克隆与分析。锌指蛋白在泛素代谢中的SCF(Skp1/Cul1/F-box)复合物中发挥重要作用,转基因寄主植物介导的RNAi表明该基因在植物线虫的致病过程中发挥重要作用(Sindhu et al., 2009)。这些基因在松材线虫致病过程中的作用还有待于基因全长cDNA克隆与功能分析。此外,本研究获得的松材线虫虫体特异表达的34个Contig中,仅有15个有明确的功能注释,除了松材线虫致病相关基因外,也包含了线虫精子细胞的运动蛋白(nematode sperm cell motility protein)、衰老相关蛋白(senescence-associated protein)、肌钙结合蛋白(calponin)等线虫繁殖和发育相关基因(Stewart et al., 2005Yoon et al., 2004),其他12个基因未获得明确的功能注释,其中也包括部分表达丰度较高的EST,这些基因的功能及其与松材线虫取食和致病性之间的关系还有待于进一步研究。

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