远缘杂交是获得植物优良品种的有效途径之一，研究远缘杂交材料的育性，筛选远缘杂交组合，对指导远缘杂交育种工作具有重要的意义。

牡丹(Paeonia suffruticosa)、芍药(Paeonia lactiflora)同属于芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)植物，芍药属由3个组组成，即牡丹组(Section Moutan)、芍药组(Section Paeonia)和北美芍药组(Section Oneapia)。牡丹组属亚灌木，野生种8个，全部原产于我国。芍药组属宿根草本，野生种22个，原产我国的有9个(李嘉珏，1999)。我国现有牡丹品种约1 200个，芍药品种约300个，且集中于中原品种和西北品种2个类群，其中80%左右属中原品种群。培育牡丹、芍药新奇品种是园艺工作者努力的方向。近年来，国内外芍药属牡丹组内种间杂交新品种不断出现，但芍药属组间杂交成功的报道很少。世界上第1个牡丹与芍药组间杂交后代‘伊藤杂种’(‘Itoh Hybrid’)初次开花(橋田亮二，1995)，引起了园艺界的关注，远缘杂交作为培育新品种的有效途径越来越受到牡丹、芍药育种工作者的重视(何桂梅等，2006)。2008年我国首次报道了牡丹与芍药的远缘杂种‘和谐’，从形态学和分子生物学两方面证实了‘和谐’为牡丹与芍药远缘杂交形成的新材料(郝青等，2008；Hao et al., 2008)。‘和谐’杂种优势明显，花期介于牡丹和芍药之间，具有较高的观赏价值。为了加速我国牡丹、芍药传统名花的育种进程，建立我国牡丹与芍药远缘杂交育种体系，本研究从2005—2009年对远缘杂种‘和谐’的雌雄蕊形态特征、花粉活力、授粉过程、杂交结实情况等影响其育性的关键因素和环节进行了系列研究。

1 材料与方法 1.1 试验材料

牡丹与芍药远缘杂种‘和谐’，与‘和谐’花期相近的芍药品种‘艳紫’(‘Yanzi’)和‘粉蝴蝶’(‘Fen Hudie’)，杨山牡丹(P. ostii)品种‘凤丹’(‘Fengdan’)和紫斑牡丹(P. rockii)品种‘蓝海银波’(‘Lanhai Yinbo’)。其中，除‘和谐’外，其他4种材料育性正常，田间自然杂交结实率均较高。每种材料各5株，均为3年生以上、生长健壮、开花正常的植株。取样、杂交均在中国科学院植物研究所北京植物园牡丹与芍药种质资源圃中进行。

1.2 试验方法 1.2.1 ‘和谐’雌雄蕊形态观察

取初开期的新鲜花朵，去掉花瓣和萼片，肉眼观测后置于尼康SMZ1000型体式显微镜下进一步观测雌雄蕊形态结构并拍照。取露色期的花朵，摘取花药，切取柱头，置于FAA固定液(50%乙醇:冰醋酸:甲醛＝89:6:5，体积比)中固定24 h以上，样品经乙醇梯度(70%—80%—90%—100%)脱水、乙酸异戊酯置换、二氧化碳临界点干燥、粘台、喷金和镀膜后，置于日立S-4800型扫描电镜下观察并拍照。

1.2.2 TTC法测定花粉活力

取‘和谐’刚刚开裂的花药置于0.5 mL的离心管中，加入约0.2 mL 0.5% TTC蔗糖溶液，轻轻振荡使花粉散落到溶液中，混匀后吸取溶液到载玻片上，加盖玻片后置于35 ℃恒温箱中15 min，取出后在低倍镜下观察。参照金飚等(2007)的方法观察并计算花粉活力。

1.2.3 荧光显微镜观察花粉萌发

2009年5月8日，将15朵含苞待放的‘和谐’花蕾去雄后授以混合花粉(‘艳紫’、‘粉蝴蝶’、‘凤丹’和‘蓝海银波’)并套袋，分别于授粉后8，16，24，32和64 h时各取3朵花，切取柱头和子房，用FAA进行固定，保存在4 ℃冰箱中备用。观察时先将样品浸于1 mol·L^-1的氢氧化钠溶液中，80 ℃水浴1.5 h，水洗后用1 mol·L^-1的盐酸中和剩余的碱液，再次水洗后用0.1%脱色水溶性苯胺蓝染色5~10 h，压片，置于300~400 nm的荧光显微镜下观察花粉粒的萌发、花粉管进入柱头及其在柱头中的生长情况。

1.2.4 人工杂交试验

2005—2009年，以‘和谐’为母本，‘艳紫’、‘粉蝴蝶’、‘凤丹’、‘蓝海银波’为父本；以‘艳紫’、‘粉蝴蝶’、‘凤丹’、‘蓝海银波’为母本，‘和谐’为父本进行正反交杂交育种试验。每年4月中旬至5月中旬，选取父本植株含苞待放的花朵，花药散粉前摘取花药，置于室内干燥处晾干，第2天自然散粉后收集花粉待用。选取母本植株上发育良好的花蕾，花蕾露色时、花药散粉前去雄，用毛笔授花粉，并套袋标记。每一组合杂交5朵花，连续3天重复授粉3次，授粉时间在11:00前或17:00后。8月下旬种子成熟时，统计结实情况。

2 结果与分析 2.1 ‘和谐’的雌雄蕊特征

‘和谐’开花前后花萼上无蜜露分泌，花朵单瓣型(图版Ⅰ-1)。牡丹和芍药雄蕊数量一般为150~300枚(李嘉珏，1999)，花丝长度基本一致，而‘和谐’的雄蕊量明显减少，数量50~100枚，花药及花丝均呈黄色或乳黄色，花丝长短不一，最短的0.1 cm、最长可达2.5 cm；花药散粉量少，花粉易结块粘连；扫描电镜下，正常的花粉数量少，近球形，极面观为三裂圆形(图版Ⅰ-2)，赤道面观近圆形(图版Ⅰ-3)，外壁具网纹结构(图版Ⅰ-4)；多数花粉败育，呈不同程度的干瘪状，且粘连在一起(图版Ⅰ-5)；用TTC法测得花粉活力为4.1%。‘和谐’的雌蕊离生，与牡丹、芍药相似，更接近芍药，心皮4~5个，表面密生白色柔毛；花盘浅粉色，肉质，边缘不整齐，包裹心皮程度介于牡丹和芍药之间，约占整个心皮的2/3(图版Ⅰ-6)。柱头紫红色，向外呈耳状卷曲，柱头授粉面积为顶部宽约1 mm的狭长带(图版Ⅰ-7)，其表面具有明显的乳头状突起，花粉萌发后从这些乳突细胞的间隔进入柱头(图版Ⅰ-8)。胚珠多数，着生于腹缝线上，为边缘胎座(图版Ⅰ-9)。

2.2 ‘和谐’柱头上的花粉萌发

经0.1%水溶性苯胺蓝染色后，牡丹与芍药(芍药‘艳紫’和‘粉蝴蝶’、杨山牡丹‘凤丹’、紫斑牡丹‘蓝海银波’)混合花粉的花粉粒在López477201220紫外荧光显微镜下呈橘红色，花粉管呈灰蓝色。花粉在‘和谐’柱头上萌发率较高，无萌发障碍。萌发后的花粉管成团盘绕在柱头上，部分花粉管内出现大量不规则沉积的胼胝质，在紫外光下产生较强的荧光(图版Ⅰ-10)。少数花粉萌发后花粉管扭曲，顶端膨大(图版Ⅰ-11)，在柱头上即停止生长。授粉后8 h，没有观察到萌发的花粉管进入柱头组织；授粉后16 h，少数萌发的花粉管进入柱头组织，到达花柱的1/10位置(图版Ⅰ-12)；授粉后24 h，花粉管进入到花柱的1/6位置，在花柱内生长的部分花粉管的顶端开始膨大，逐渐积累胼胝质(图版Ⅰ-13)，花粉管生长也逐渐受到抑制；授粉后32 h，花粉管进入花柱的1/2位置；授粉后64 h，花粉管仍停留在花柱的1/2位置，未见花粉管伸长至子房完成受精过程。

2.3 ‘和谐’的杂交结实情况

‘和谐’作母本时，所试杂交组合均不结实。人工授粉后2~3天其柱头由紫红色变为褐色，随后子房迅速膨大到原体积的1.5~2倍，子房壁变硬。授粉后45天，将‘和谐’的蓇葖果纵剖，发现里面的胚珠全部萎缩败育，呈黑色(图版Ⅰ-14)。8月中旬‘和谐’的蓇葖果正常开裂，但无种子(图版Ⅰ-15)。‘和谐’作父本，牡丹品种‘凤丹’和‘蓝海银波’作母本的杂交组合也未结实；但以‘和谐’作父本，芍药品种‘艳紫’、‘粉蝴蝶’作母本的杂交组合获得了少量种子，不同年份代表性杂交组合的结实情况见表 1。其中，2005年‘粉蝴蝶’ב和谐’结实9粒，当年播种后第2年出苗6株，2009年5月上旬调查发现，这6株杂种苗中的4株开花，花期介于牡丹和芍药之间，开花性状见表 2。

3 结论与讨论 3.1 ‘和谐’不结实的原因

被子植物双受精过程包括花粉在柱头上萌发、花粉管沿花柱生长、精细胞释放、精卵结合等一系列复杂的过程(徐恒平等，1995)，花粉与柱头、花粉管与花柱及雌雄配子之间3个层次中任何一个层面的不亲和都会降低受精率(胡适宜，2005)。在植物远缘杂交过程中，受精前障碍(异源花粉与雌蕊不亲和)和受精后障碍(受精胚败育)均能导致不结实(睢薇等，1999；李瑞芬等，2001；李辛雷等，2008；孙春青等，2009)。正常的牡丹、芍药双受精过程中，花粉管在授粉后2~3 h内便可进入胚珠(李嘉珏，1999)。牡丹和芍药混合花粉在‘和谐’柱头上大量萌发，大部分不能进入柱头；少数花粉管进入柱头，但授粉后32 h因先端膨大、胼胝质积累而停止生长，仅到达花柱1/2位置，说明‘和谐’作母本与牡丹、芍药杂交不亲和是由受精前障碍导致的。因此，克服‘和谐’受精前障碍、促进受精过程顺利完成将是下一步研究的重点。

3.2 ‘和谐’的育种前景

目前，我国栽培的牡丹品种主要源于杨山牡丹和紫斑牡丹2个野生种，芍药品种主要源于芍药这1个野生种，牡丹、芍药品种相对单一，花期十分集中。牡丹与芍药远缘杂种‘和谐’的出现丰富了我国牡丹与芍药的类型，特别是‘和谐’的花期填补了牡丹和芍药花期的空档，具有极高的观赏应用前景。

尽管国外已培育出了不少牡丹与芍药组间杂种，但均高度不育，雄蕊常呈花丝状，花药无花粉或少量花粉(Page，2005；王越岚，2009)。本研究结果表明‘和谐’的花粉活力为4.1%，说明‘和谐’雄性有一定的育性；‘和谐’作父本与‘艳紫’和‘粉蝴蝶’2个芍药品种连续多年杂交试验获得了少量的种子和种苗，表明‘和谐’与芍药杂交有一定的亲合力。‘和谐’是珍贵的牡丹与芍药远缘杂交育种材料，将在今后牡丹与芍药远缘杂交育种中发挥桥梁作用。‘和谐’与2个牡丹品种的多年杂交试验均未获得过种子，说明‘和谐’与牡丹的杂交亲和力不如芍药。造成二者亲和力差异的原因，可能与‘和谐’与芍药的亲缘关系比‘和谐’与牡丹的亲缘关系近有关(郝青等，2008；Hao et al., 2008)。为了加快我国传统名花牡丹与芍药的育种步伐，促进产业化的发展，推进牡丹与芍药远缘杂交育种工作，尽快确认‘和谐’的父母本，筛选与‘和谐’亲和力强的牡丹、芍药杂交组合，加强杂种后代的科学鉴定等工作显得越来越重要。