植物或微生物产生的特定生化物质释放到环境中，对其他植物或微生物产生直接或间接的抑制或促进作用，即为化感作用。Brian等(1951)报道土壤中常见的青霉菌(Penicillium griseofulvum)在土壤中产生的灰黄霉素可以抑制燕麦(Avena sativa)的生长; 赵勇斌等(1985)报道雷蘑(大白桩菇) (Leucopaxillus giganteus)可以促进牧草的生长。刘建成等(1995)报道红汁乳菇(Lactarius hatsudake)周围有特殊蘑菇圈现象，它常与白茅(Lmperata cylindrica)、黄茅(Heteropog oncontortus)和狗牙根(Cynodon dactylou)等伴生，其周围少见双子叶和其他单子叶的草本植物。胡江春等(1998)发现土壤紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)分泌的毒素对连作大豆(Glycine max)生长发育全过程具有危害作用，这是大豆连作减产的主要原因之一。曾任森等(2004)报道日本曲霉(Aspergillus japonicus)所产生的大量黑麦酮酸F在低浓度时显著促进玉米(Zea mays)幼苗生长，高浓度则抑制玉米幼苗生长。杨敬辉等(2006)报道了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis K12)能抑制棉花(Gossypium herbaceum)枯萎病菌(Fusarium oxysporium)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒根腐病菌(Fusarium solani)及水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)等病原菌的生长。陶黎明等(2006)从广西采集的土壤样品中分离得到一株淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)，它能产生化感物质染料木素、黄烷酮和槲皮素对农田杂草具有很强的抑制作用。因此，微生物对高等植物化感效应研究越来越成为化感作用研究的热点，具有重要的实践意义。

调查发现大青山油松(Pinus tabulaeformis)与虎榛子(Ostryopsis davidiana)混交林中油松的生长状况明显好于油松纯林。研究发现虎榛子对油松菌根形成具有明显的促进作用(Bai et al., 2009)，同时其混交林根际土壤酶活性远远高于油松纯林(邵东华等，2008)，以及油松与虎榛子混交林微生物功能多样性指数显著高于油松纯林(齐雅静等，2011)。混交林的生长效应是否还与虎榛子根际微生物的化感效应有关，是本研究的切入点。本研究以大青山自然分布的虎榛子根际土壤中几种优势真菌为研究对象，试图从微生物化感作用角度揭示内蒙古大青山油松与虎榛子互惠共存中微生物的作用机制。

供试菌种分离于内蒙古大青山虎榛子灌丛纯林根际土壤的5种真菌。经纯化鉴定，初步筛选拟青霉属(Paecilomyces) 3菌株(以下分别简称P1、P2、P3)，葡萄穗属(Stachybotrys) 1菌株(以下简称S1)，胶帚霉属(Gliocladium) 1菌株(以下简称G1)。供试油松种子由内蒙古自治区林木种苗站提供。

1) 真菌次生代谢物制备  将250 mL马丁氏液体培养基分别装入容量为500 mL罐头瓶中，高压灭菌25 min(118 ℃，1 kg·cm^{－ 2})。每瓶分别接种已培养好的直径2 mm的菌饼10块，用无菌封口膜封住瓶口，放入28 ℃摇床上振荡(160 r·min^{－ 1})，暗培养15天后备用，每个菌株20个重复。

2) 幼苗培养  育苗基质选择蛭石与林地土混合基质(V / V = 5 : 1)，充分混合后将基质在高压蒸汽灭菌锅(121 ℃，1 kg·cm²)内灭菌60 min，冷却后将基质装入上口直径15 cm、下口直径12 cm、高12 cm的育苗盆内，每盆盛500 g基质。将油松种子用0.5% KMnO₄消毒2 h，用无菌水清洗干净后置于发芽箱中催芽7天，待胚根露出后播入准备好的育苗盆中，每个苗盆内播1粒芽苗，出苗后培养60天对油松幼苗进行化感效应的研究。

3) 化感效益测定  将培养15天的同一菌株菌液混合物，用孔径小于3 μm的滤膜过滤培养液，再分别将过滤好的每个菌株的菌原液量取50 mL、100 mL、150 mL置于烧杯中，然后用无菌水稀释定容至200 mL后分别施入苗杯中，对照为无菌水处理，每个处理均为10个重复。最后置于温度为25 ℃ ± 2 ℃的光照培养室内，每天光照14 h。每2周浇1次稀释10倍的Hoagland营养液，每盆30 mL。再培养60天后待测定苗高、生物量。

4) 测定与计算方法  由以下公式计算不同菌株对幼苗生长指标的化感响应指数(Williamson et al., 1988) :

其中，C是由无菌水处理(对照)幼苗各指标值，T是由不同真菌处理的幼苗各生长指标值，RI代表化感效应，当RI＞0时表示促进作用，当RI＜0时为抑制作用。

5) 真菌次生代谢物的鉴定  通过真菌代谢产物化感效应研究后，筛选出对油松具有显著化感作用的3个菌株进行纯培养，15天后采用GC-MS方法对菌液进行化感物质的分析鉴定，了解其化感物质的差异。测试时，气相色谱柱为DB － 5 － MS石英毛细管柱(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm，J & W Scientific，Agilent Technologies，USA)。按常规方法分析后，采用Xcaliburl.2版本软件、NIST98谱图库兼顾色谱保留时间对真菌分泌物组分定性，并以标准样品进行验证; 通过面积归一化法以各类物质的相对含量定量。通过SAS软件对试验数据进行分析。

由图 1，2可见，拟青霉菌P1在所有浓度条件下对苗高和生物量都表现抑制作用(化感响应指数均为负值)，且抑制作用随着浓度的增加而增强; 拟青霉菌P2在浓度Ⅰ和浓度Ⅱ时对苗高和生物量具有一定的促进作用(化感响应指数为正值)，且随着浓度的增大(浓度Ⅲ)即产生抑制作用(化感响应指数为负值)。菌株P3和S1在3个浓度条件下对油松苗高和生物量均有促进作用，且随着浓度的增大促进作用增强，尤其在浓度Ⅲ时促进作用与对照存在显著的差异(P = 0.05)。菌株G1在低浓度时有促进作用，高浓度时有抑制作用，抑制作用与对照也存在显著的差异。

图 1 不同菌株代谢产物与油松苗高生长的关系 Figure 1 The relationship of the different strain metabolites and the growth of P. tabulaeformiss seedlings P1、P2、P3分别表示拟青霉属中的3个菌株，S1表示葡萄穗属的1个菌株，G1表示胶帚霉属的1个菌株，CK为对照，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别表示每500 g基质中菌液施入量: 50 mL、100 mL、150 mL。下同。 P1, P2 and P3 represent three kinds of strain of Paecilomyces, S1 represents one strain of Stachybotrys, G1 represents one strain of Gliocladium, with the CK as the control experience. Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ represent that the capacities of added strains in every 500 g matrixe are 50 mL, 100 mL and 150 mL respectively. The same below.

图 2 不同菌株代谢产物与油松幼苗生物量的关系 Figure 2 The relationship of the different strain metabolites and P. tabulaeformis seedlings' biomass

菌株P3、S1和P1代谢产物的总离子流图显著不同(图 3)。菌株P3、S1的波峰近似，代谢产物中检测出较高数量的油酸甲酯、9 －油酸(E)、9，12 －十八碳二烯酸(Z，Z)、9 －十八烯酸酰胺、六氢化吡咯并(1，2 － α)吡嗪－ 1，4 －二酮、六氢化－ 3 － (2 －甲丙基)吡咯(1，2 － α)吡嗪－ 1，4 －二酮; P1菌株中没有检测到这些物质，或由于含量低没有读出，而在P1检测出了较高数量的番茄黄素、大戟二萜醇。

图 3 P3、S1和P1三种真菌分泌物总离子流图 Figure 3 TICS of fungi exudates of Paecilomyces sp. 3, Stachybotrys sp. 1 & Paecilomyces sp. 1

化感物质浓度高低与化感作用强度有关系:张柏习等(2007)研究发现不同浓度的香草醛对樟子松(P. sylvestris var. mongolica)幼苗生长影响不同，浓度在10 mmol·L^{－ 1}时能极显著抑制幼苗生长，而浓度为0.01 mmol·L^{－ 1}时对幼苗生长有促进作用; 莫美华等(2004)研究发现红汁乳菇对水稻(Oryza sativa)、稗草(Echinochloa crusgalli)的化感作用一般在低浓度下有促进作用，高浓度下产生抑制作用，可见微生物分泌物在一定浓度范围内对植物的化感作用也产生变化。本研究中菌株P2和G1在低浓度时对苗高和生物量均有促进作用，但随着浓度的增大即产生抑制作用，这与前人研究具有相同的趋势。菌株P3和S1对苗高和生物量均有明显的促进作用，且促进作用随着浓度的加大而增强，这一研究结论与目前已报道的研究结果不同。可能本研究所设置的浓度尚不能对油松生长产生抑制作用，而是以促进作用为主。据研究，油松虎榛子不同林型根系分泌物组分存在较大的差异，并且外缘ρ －香豆酸在浓度为2.5 mg·L^{－ 1}时对油松60天幼苗具有显著的促进作用(邵东华等，2011)。所以，可以认为虎榛子与油松混交林的生长效应是综合的，包括植物和微生物的化感作用。有资料显示:笔者检测到的这些真菌代谢产物，包括油酸甲酯、9 －油酸(E)、9，12 －十八碳二烯酸、9 －十八烯酸酰胺，在一定浓度范围内是植物生长所需的营养物质，而六氢化吡咯并(1，2 － α)吡嗪^{－ 1}，4 －二酮、六氢化－ 3 － (2 －甲丙基)吡咯(1，2 － α)吡嗪^{－ 1}，4 －二酮在植物生长中的作用方式，尚未见报道。这些物质作用机制，以及分子机制方面的研究值得进一步探讨。