前人基于对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、矮牵牛(Petunia hybrida)和金鱼草(Antirrhinum majus)花同源异型突变体的研究，先后提出花器官发育的ABC模型、ABCD模型、ABCDE模型和四因子模型(Coen et al., 1991; Colombo et al., 1995; Theissen，2001; Theissen et al., 2001)。APETALA2基因作为重要的A类基因，不仅参与花分生组织的建立而且决定花萼和花瓣的形成。至今为止，研究人员已从玉米(Zea mays)、风信子(Hyacinthus orientalis)、矮牵牛、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus domestica)、草莓(Fragaria × ananassa)、枳(Poncirus trifoliata)多种植物中克隆了AP2同源基因全长cDNA (Maes et al., 2001; 宿红艳等，2005; 周盛梅等，2006; 宋长年等，2009)。但是，关于牡丹的AP2基因方面的研究未见相关报道。

牡丹(Paeonia suffruticosa)是我国的十大名花之一，也是我国的候选国花，具有较高的观赏价值。但是，由于牡丹是多年生木本花卉，自然花期相对集中，不能更好地满足市场的需求，制约了牡丹产业化的发展。牡丹花型丰富，包括单瓣型、荷花型、蔷薇型等10个类型(王莲英，1998)，是深入研究花发育ABCDE模型的良好的试验材料。本研究拟通过RT-PCR和RACE技术获得该基因全长，检测其在不同器官中的表达，为探究AP2基因在牡丹发育过程中的作用，特别是为牡丹花型定向遗传改良和品种创新提供新的理论依据和基因资源。

1 材料与方法 1.1 材料

以牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suffruticosa ‘Zhaofen’)花瓣为试材，于花蕾透色期(袁涛等，2004)采收自中国林业科学研究院北京良乡基地，锡箔纸包好后立即用液氮速冻，存于-80 ℃冰箱备用。

RNA提取所用药品均购自北京拜尔迪生物公司，M-MLV反转录酶购自Promega公司，Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、大肠杆菌TOP10感受态细胞、质粒DNA提取试剂盒和DNase Ⅰ酶等购自天根生化科技有限公司，SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit为Clontech公司产品。克隆载体pMD-19 T Simple Vector购自Takara公司。引物合成及DNA序列测定委托北京奥科生物公司完成。

1.2 方法 1.2.1 基因全长的克隆

花瓣总RNA提取采用CTAB法(孟丽等，2006)。根据NCBI已登陆的与牡丹亲缘关系较近其他物种的AP2基因序列的保守区域设计1对简并引物M1，M2 (表 1)。以花瓣RNA反转录产物cDNA第1链为模板，95 ℃预变性4 min; 然后，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环; 最后72 ℃延伸7 min进行PCR扩增。凝胶回收与预期片段大小一致的泳带，连接克隆载体并转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定后，进行序列测定。根据所得的中间序列设计特异性引物M3，M4(表 1)，按照试剂盒SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行RACE扩增。扩增程序为94 ℃变性30 s，72 ℃延伸3 min，5个循环; 94 ℃变性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5个循环; 94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，25个循环。将中间序列以及两端序列进行拼接，通过NCBI数据库ORF Finder工具找出该基因的ORF，设计引物M5和M6进行编码区验证扩增。扩增程序为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。产物克隆及测序如上所述。利用DNAman软件进行多序列比对及同源性分析。

1.2.2 生物信息学分析

在瑞士生物信息学研究所网站(http://us.expasy.org/)上运用Compute pI/ Mw软件对目的基因编码蛋白等电点和分子量进行预测，并运用ProtScale软件对其疏水性预测分析。运用PBIL LYON-GERLAND信息库对蛋白质序列进行二级结构预测，采用SMART软件对编码蛋白结构域进行预测(http://smart.embl-heidel-berg. de/)，通过Swiss-Model Workspace对其三级结构进行预测。

1.2.3 相对荧光定量PCR表达分析

于盛花期分别提取牡丹品种‘赵粉’的萼片、花瓣、雄蕊、心皮、根、茎、叶等器官的总RNA，用DNase Ⅰ酶(RNase free)消化基因组DNA后，各取500 ng为模板，反转录合成cDNA第1链。根据PsAP2 cDNA全长序列，按照荧光定量PCR引物设计原则在PsAP2的3'非翻译区附近设计1对特异引物M7和M8 (表 1)，获得的扩增片段为162 bp。以牡丹β-微管蛋白基因β-Tubulin(EF608942)为内参，设计其特异引物Tub-F和Tub-R(表 1)，获得的扩增片段为182 bp (周琳等，2010)，进行相对荧光定量分析。

反应在ABI 7500实时定量PCR仪上进行，方法参照《美国应用生物系统公司7300/7500实时定量PCR仪相对定量实验入门指南》和荧光定量试剂盒SYBR PrimeScript^TM RT-PCR Kit (TaKaRa)说明书。反转录的反应体系为:总RNA 2 μL，5 × PrimeScript^TM Buffer 4 μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，Random primer (100 μmol·L^-1)和Oligo dT primer(50 μmol·L^-1)各1 μL，加水(RNase free)补足20 μL。荧光定量PCR扩增的反应体系为: cDNA模板2 μL，2 × SYBR Premix Ex Taq^TM 10 μL，特异引物(10 μmol·L^-1) 0.4 μL，50 × ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，用水补足20 μL。采用两步法标准程序: 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性34 s，共45个循环。

每个试验设3次重复，利用ABI 7500 PCR仪Sequence Detection software软件(2^-ΔΔC_t法) (Livak et al., 2001)进行数据分析。

2 结果与分析 2.1 牡丹PsAP2基因同源片段的克隆

以牡丹花瓣的cDNA为模板，利用简并引物M1，M2进行PCR扩增，得到239 bp的片段。Blast分析发现，该核苷酸序列与许多植物AP2同源性都大于70%，与苹果(GU983666.1)的最高，达到86%，初步推断其为牡丹AP2基因的同源片段。

2.2 牡丹PsAP2基因cDNA全长的获得及序列分析

根据RT-PCR得到的中间序列分别设计了特异性引物M3，M4，按照RACE试剂盒说明书，分别合成3'与5'-RACE cDNA第1链，然后进行末端序列扩增。将产物进行凝胶电泳分析，测序结果表明，3'端序列为1 560 bp，5'端为660 bp。设计引物M5和M6进行ORF扩增验证，经测序表明其序列为1 550 bp。

将RT-PCR及RACE-PCR扩增片段拼接，最终获得长度为2 138 bp的牡丹AP2 cDNA全长序列(图 1)，命名为PsAP2，GenBank登录号为HM167511。利用NCBI提供的ORF Finder进行分析发现，该cDNA全长包含有1个1 533 bp的开放读码框和1个poly (A)尾巴，5'非翻译区长47 bp，3'非翻译区长557 bp，编码510个氨基酸。

2.3 生物信息学分析

预测PsAP2基因编码蛋白的等电点为6.66，分子量为57.01 ku。其编码蛋白的疏水性分析表明，疏水性最大值为1.278，最小值为-3.589，总体看来大部分区域为亲水区(图 2A)。二级结构预测表明，PsAP2蛋白由90个ɑ螺旋，89个延伸链和331个随意卷曲构成，它们分别占到17.65%，17.45%和64.90% (图 2B)。另外，对其编码的氨基酸序列进行分析发现，该基因包含目前已知的AP2特有的2个特征域，分别位于151—213氨基酸位点和243—306氨基酸位点(图 2C)。三级结构预测，其模型相似度与lgccA模型达到46.77% (图 2D)。PsAP2基因编码的氨基酸序列具有AP2结构域和核定位信号，属于AP2家族(图 3)。

牡丹PsAP2氨基酸序列提交NCBI在线比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，选择与其同源性较高的11个物种的AP2氨基酸(图 4) :拟南芥(Arabidopsis thaliana NP_201519.1)、毛果杨(Populus trichocarpa XP_002303783. 1)、番茄(Solanum lycopersicum ACD62792. 1)、豌豆(Pisum sativum XP14326. 1)、苹果(Malus domestica AAL57045. 2)、欧洲油菜(Brassica napus ADU04499. 1)、黑松(Pinus thunbergii BAD16603.1)、欧洲云杉(Picea abies AAG32658.1)、葡萄(Vitis vinifera ACO52508.1)、枳(Poncirus trifoliata ACG63707.1)、矮牵牛(Petunia hybrida AAD39439.1)。使用DNAman软件将这些序列进行比对(图 4)发现:不同植物的氨基酸序列同源性不高，其中牡丹与葡萄的同源性最高，达到71%。

在多重比对的基础上，为进一步了解PsAP2与其他植物AP2之间的进化关系，用上述12个AP2的氨基酸序列构建了系统进化树(图 5)。裸子植物黑松和欧洲云杉形成1个分支，茄科(Solanaceae)的矮牵牛和番茄形成1个小分支，表现出一定的种属特性。

2.4 相对荧光定量PCR表达分析

以牡丹β-Tubulin基因为内参照，采用荧光定量PCR的方法对牡丹不同器官中PsAP2的表达进行检测，结果(图 6)表明，PsAP2不同器官中均有表达。表达量从高到低依次为花瓣、心皮、茎、萼片、根、雄蕊、叶。其中花瓣表达量最高，叶片最低。花瓣中表达量是叶片中的6.4倍。

3 讨论

本研究通过RT-PCR和RACE方法从牡丹花瓣中成功分离出AP2的同源基因PsAP2，该基因编码的蛋白质具有AP2家族典型的特征，即含有保守性很高的2个识别并结合DNA顺式作用元件的AP2结构域(Kim et al., 2005)、1个丝氨酸丰富的转录激活结构域和1段核定位序列KKSR (Chelsky et al., 1989)，说明PsAP2的编码产物为转录因子，属于AP2/EREBP家族的AP2亚家族。

基因序列同源性分析发现，AP2编码区保守性不强，不同科植物间核苷酸水平上和氨基酸水平上的同源性都不高，预示它们在功能上可能存在较大的差异。本研究以包括PsAP2在内的14个物种的AP2蛋白质氨基酸序列构建系统进化树，结果发现，PsAP2的进化具有一定的种属特性。

AP2在拟南芥的四轮花器官均有表达(Jofuku et al., 1994)。风信子HAP2在叶和花被片中有所表达(Li et al., 2001)。宿红艳等(2005)采用RT-PCR方法研究表明:草莓SAP2基因在营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达。周盛梅等(2006)对苹果的AP2的同源基因MAP2研究表明:苹果的花瓣、萼片、雌蕊、雄蕊中都有表达。宋长年等(2009)对枳的AP2同源基因Pt-AP2研究发现在枳的叶、茎、根、花、果等各个器官均有表达，其中在花和果实中的表达量分别最高与最低。本研究通过荧光定量PCR技术研究表明，PsAP2在牡丹四轮花器官中均有表达，这与前人研究结果基本一致。说明PsAP2广泛参与到花发育的各个阶段。传统的半定量PCR技术，大都通过改变模板的量或者调节循环次数，通过内参的变化，肉眼判断各个模板的表达情况，具有一定的局限性。本试验采用的相对荧光定量技术，比传统的半定量PCR技术更准确。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20 ~ 25个核苷酸。它们通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或者阻碍其翻译。miRNA172对AP2的调控作用也成为近年来的研究热点。miRNA172由21个核苷酸组成，它与靶基因的结合位点也是高度保守的，在欧洲云杉、智利大麦(Hordeum chilense)、大麦(Hordeum vulgare)中均有证实(Kim et al., 2006; Nilsson et al., 2007; Gil-Humanes et al., 2009)。Aukerman等(2003)研究发现，拟南芥中35S: miRNA172的花表现出AP2性状，暗示miRNA172下调了AP2活性，并且AP2的RNA在35S: miRNA172里不受影响，但蛋白水平降低。原位杂交试验结果显示，miRNA172在第3，4轮花器里的表达强度最高。这些事实说明，miRNA172是AP2的负调控因子，它抑制了AP2在第3，4轮里的翻译，从而推翻了前面AP2局限于第1，2轮里的结论。miRNA172的发现，对ABC模型与实际不能圆满吻合的部分作出了解释。ABC模型推测，A，C类基因相互抑制，C类基因活性缺乏时，A类基因表达于花所有的4轮结构中，从而抑制AG在第3，4轮的转录。事实上，Gustafson-Brown等(1994)在拟南芥ag突变体试验中发现，在花器官发育的整个过程中，AG的mRNA始终在第3，4轮花器中表达。而按ABC模型法则推理，缺少了C基因活性，A类基因功能会作用于整个花，相应的第3，4轮里不应该有C类基因的表达。miRNA172的发现，终使这一疑惑有了诠释。ag突变体的第3，4轮里，miRNA172抑制了AP2，所以第3，4轮里的AG不会受到抑制，在第3，4轮里出现了AG mRNA的表达(Aukerman et al., 2003; Gustafson-Brown et al., 1994; 赵奇等，2005)。

本文成功构建的PsAP2正义和反义表达载体，为更好地认识PsAP2的功能及其在花发育过程中的作用，培育出更多的花型优美的牡丹新品种奠定了基础。