青杨天牛(Saperda populnea)属于鞘翅目天牛科，是我国北方地区杨树枝梢的主要害虫之一，“三北”地区为害更为严重，以幼虫蛀食枝干，被害处形成纺锤状虫瘿，阻碍养分的正常运输，致使枝梢干枯或风折，造成树干畸形，影响成材; 如在幼树干髓处为害，还可使整株树死亡(孙守慧等，2009a)。在昆虫与植物的相互作用关系中，次生代谢物质是植物对昆虫的化学防御机制之一。然而，植食性昆虫能够在寄主植物上完成生长发育过程，其重要原因就在于虫体自身具有相应的对寄主植物次生代谢物质的代谢适应能力(钦俊德，1987; 1995)。昆虫对待寄主植物中有毒的次生代谢物质可通过羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、多功能氧化酶等解毒酶(Dauterman，1988)将其转化为非毒性物质，从而使昆虫能够适应取食对象。在烟草夜蛾(Helicoverpa armigera)(谭维嘉等，1990)、小菜蛾(Phitella xylostella)(李云寿等，1996)、棉蚜(Aphis gossypii)(高希武，1992)等昆虫中均已证实:当取食不同寄主植物时，昆虫的解毒酶活性会发生明显改变，这种改变通常被认为是次生代谢物质的诱导作用导致的(张彦广等，2001)。此外，昆虫体内的保护酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)也与其抗逆性密切相关(李周直等，1994; 蒋志胜等，2003; Lozinskaya，2004)。根据笔者对青杨天牛寄主杨树次生代谢物质的分析研究(孙守慧，2009b)，挑选10种主要的次生代谢物质进行幼虫饲喂和酶活性研究，探求次生代谢产物对青杨天牛的抗性机制。

1 材料与方法 1.1 材料

供试的青杨天牛幼虫于2007年9月和2008年10月采于吉林省长岭县太平川林场，每批次2 000个虫瘿，寄主为黑林1号[(P. simonii×P. nigra)×P. euramericana cv. 15A]。

供试的10种次生代谢物质如下:单宁购自Alfa Aesar公司，水杨甙和丁香酸购自Sigma公司，苯酚、香豆酸、对羟基苯甲酸和水杨酸均购自Fluka公司，阿魏酸和绿原酸购自Acros公司，肉桂酸购自Adrich公司。

1.2 人工饲养的方法 1.2.1 半人工饲料的配制

将从寄主杨树采集到的直径0.9~1.4 cm的2年生枝条，冲洗、剥皮、粉碎成锯末状后，放入冰箱(5 ℃)冷藏待用; 称取蔗糖、碳酸钙和氯化钙、磷酸二氢钾和琼脂(表 1)，加入42 mL蒸馏水中加热溶解，再加入待用的杨树锯末混匀，高压灭菌后，待混合物冷却至50 ℃以后，分别加入维生素C和红霉素，混匀。将配制好的饲料放入5 ℃冰箱静置1天后使用(使用前将饲料温度升至室温)。

试验所用的次生物质有10种，加上对照每组共有11种。根据杨树树皮内各种次生物质的含量，每种次生物质都设2个供试含量(表 2)。用天平称出适量的次生代谢物质，放入烧杯中，分别加入10 mL蒸馏水稀释搅拌，混入已制备好的90 g人工饲料中。

1.2.2 试虫的饲养

在超净工作台上，将饲料放入盛有滤纸的培养皿再轻轻放入幼虫，使其自动取食，再在滤纸周围放上浸湿的纱布保持湿度，并置于25 ℃恒温黑暗条件下培养，每个处理饲养10~15只幼虫，每2天观察1次幼虫的死亡率。

1.3 酶的测定 1.3.1 样品处理

每组取4头虫体放入预冷后的研钵中，加入pH 7.0，0.1 mol·L^-1的磷酸缓冲液2 mL冰浴下匀浆，将磨好的匀浆放入5 mL离心管中，4 ℃，9 000 r·min^-1离心30 min，取上清液，加入磷酸缓冲液至4 mL待用。

1.3.2 酶源蛋白质含量测定

反应体系为1头·mL^-1的酶源0.05 mL，蒸馏水0.95 mL，0.02%的考马斯亮兰G-250(CBB-G250)3.0 mL，总体积4 mL。混匀后，反应5 min，用分光光度计测595 nm处OD值，重复3次。根据蛋白质标准曲线方程求解酶源蛋白质含量。

1.3.3 保护酶的测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性，参照氮蓝四唑方法测定; 过氧化氢酶(CAT)活性，参照高锰酸钾滴定法测定(郝建军等，2006)。

1.3.4 解毒酶的测定

羧酸酯酶活性，参照van Asperen(1962)方法测定; 谷胱甘肽S-转移酶活性，参照孙耘芹等(1987)方法测定; α-乙酸萘酯酶活性，参照Van Asperen(1962)方法测定。

1.4 数据处理

采用DPS 3.0对试验数据进行单因素方差分析。死亡率(%)=(1-活虫数量/放入培养皿的总虫数)×100%。

2 结果与分析 2.1 杨树次生代谢物质饲喂青杨天牛幼虫

由表 3可见:对照饲喂的青杨天牛幼虫的累计死亡率在816 h超过50%，单宁处理2在384 h饲喂青杨天牛幼虫的累计死亡率超过50%，处理1含量对死亡率影响不明显; 苯酚处理1在336 h的累计死亡率就能超过50%，而更高含量的处理2水平死亡率在912 h后还没有达到50%。

由表 4可见:水杨甙2个含量的处理饲喂青杨天牛幼虫在384 h和672 h的累计死亡率都超过50%;水杨酸处理1在768 h累计死亡率超过50%，而处理2水平死亡率在912 h后还没有达到50%。

由表 5可见:丁香酸2个含量饲喂的青杨天牛幼虫的累计死亡率在336 h都能超过50%，与对照相比对死亡率影响非常明显; 香豆酸处理1和处理2分别在384 h和768 h饲喂青杨天牛幼虫的累计死亡率超过50%。

由表 6可见:绿原酸处理1和处理2含量分别在336 h和672 h累计死亡率超过50%;肉桂酸在624 h和336 h累计死亡率超过50%。

由表 7可见:对羟基苯甲酸处理1和处理2含量分别在528 h和336 h累计死亡率达到成超过50%;阿魏酸处理1在576 h累计死亡率超过50%，处理2与对照相近，影响不显著。

综上，随着处理时间的增加，饲喂不同次生代谢物质对青杨天牛幼虫的累计死亡率影响较大，与对照相比，2.0，20.0 mg·g^-1的丁香酸、16.00 mg·g^-1的苯酚、8.00 mg·g^-1的肉桂酸、50.00 mg·g^-1的对羟基苯甲酸和4.00 mg·g^-1的绿原酸均使青杨天牛幼虫累计死亡50%的时间提前到336 h左右，对青杨天牛的死亡率影响显著。

2.2 次生代谢物质与青杨天牛幼虫酶活性的关系 2.2.1 保护酶

经饲喂次生代谢物质后，青杨天牛幼虫体内SOD活性显著升高，SOD活性顺序由高到低为丁香酸＞肉桂酸＞香豆酸＞苯酚＞水杨甙＞绿原酸＞水杨酸＞阿魏酸＞对羟基苯甲酸＞单宁＞CK(表 8)。方差分析结果表明:不同次生代谢物质对幼虫体内CAT活性无显著影响。

2.2.2 解毒酶

幼虫体内谷胱甘肽酶活性较对照提高不显著，而饲喂丁香酸、香豆酸、水杨甙后，该酶活性显著降低。饲喂单宁后，乙酸萘酯酶的活性均显著提高，达到1.40α-NA mmol^-1 · mg^-1(30 min)^-1; 饲喂丁香酸、水杨甙后，该酶活性显著降低。经饲喂次生代谢物质后，幼虫体内的羧酸酯酶活性较对照出现不同程度的降低，其中肉桂酸处理后该酶活性最低，仅为0.01α-NAmmol^-1·mg^-1(30 min)^-1(表 9)。

3 讨论

毛白杨(Populus tomentosa)树皮内含物对光肩星天牛(Anopluphora glabripennis)的抗性的研究表明(王蕤等，1995):一些酚酸、酚甙的存在及其含量的差异与其抗虫性的强弱相关联; 李会平(2003)等认为:杨树体内苯酚、阿魏酸、邻苯二酚、丁香酸、绿原酸和水杨甙的含量与光肩星天牛幼虫的孵化率间呈负相关，即酚类含量越高，对天牛的抗性越强; 本研究发现苯酚、丁香酸、肉桂酸、对羟基苯甲酸和绿原酸能够明显对青杨天牛幼虫的死亡率产生影响。上述结果基本一致。饲喂试验表明:不同次生代谢物质对青杨天牛幼虫的致死作用不同，本研究结果中苯酚、水杨酸、香豆酸、绿原酸和阿魏酸都存低含量的死亡时间较高含量的死亡率时间提前的现象，其原因可能是苯酚和酚酸在高含量下青杨天牛幼虫取食减少所致，因为在饲喂试验时观察到这些幼虫从饲料中爬出的数量明显多于对照和添加低含量次生代谢物质饲料的情况。

昆虫体内存在着超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等保护酶，当昆虫受到化学刺激等逆境胁迫后，3种酶协调作用，防止自由基毒害(李周直等，1994; 蒋志胜等，2003; Peric-Mataruga et al., 1997)。关于昆虫保护酶的研究层出不穷，多集中在昆虫保护酶与杀虫剂抗药性关系之间，有关寄主次生代谢产物对昆虫保护酶的影响规律的报道较少。本研究证实饲喂苯酚、丁香酸、肉桂酸，导致幼虫死亡加速与其体内SOD活性显著升高现象相一致。杨树体内次生代谢物质能够显著提高青杨天牛幼虫SOD活性，说明当虫体受到刺激后，其体内的自由基清除机制启动。

昆虫解毒酶是一类异质酶系，对分解大量的内源或外源有毒物质(Gordon，1961)、维持正常生理代谢起着重要作用(李小珍等，2007)。杨树体内次生代谢物质对虫体解毒酶活性影响的研究结果表明:丁香酸、和绿原酸能刺激幼虫体内羧酸酯酶活性升高，苯酚则能刺激幼虫体内谷胱甘肽S-转移酶活性升高(王程等，2007)。张彦广等(2001)也认为杨树苯酚、香豆酸、丁香酸、水杨酸和水杨甙能够刺激谷胱甘肽S-转移酶活性升高，对羟基苯甲酸含量降低，幼虫体内该酶含量升高。而本研究结果与以上结论不符，发现对羟基苯甲酸能够显著提高幼虫体内谷胱甘肽酶活性，且供试次生代谢物质均能不同程度地降低幼虫体内的羧酸酯酶活性，这可能与供试天牛的种类、寄主的品种和试验的方法都有关; 这些结论还有待进一步研究探讨。由此可见植物的化学抗虫性是非常复杂的，在寄主植物与昆虫解毒酶关系方面的研究，还只是集中在羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、多功能氧化酶上(张彦广等，2001)，应该看到昆虫取食对象对虫体生理代谢的影响必定是多方面或综合性的。通过分析诱导解毒酶活性改变的取食因素，了解二者之间的相互作用关系和取食因素对青杨天牛的化学防御机制，进而全面考虑与虫体生理代谢相关的次生代谢物质种类及其生理效应，对抗性树种的选育将有理论指导意义。