我国是竹类植物分布和起源的中心地区之一, 拥有丰富的竹类植物资源、广阔的竹林面积和巨大的竹材蓄积量。竹类植物具有显著的生态、经济和社会价值。目前, 竹产业的高效发展主要依靠对天然竹资源的高效培育和竹产品的精深加工, 在人工培育新品种方面的研究则明显滞后, 不利于竹产业的可持续发展。

我国南方地区分布着多种多样的丛生竹种, 但由于其耐寒性较差, 大多数仅能在南岭以南地区野外越冬, 在南岭以北至淮河以南的广大区域中丛生竹资源较为匮乏, 仅少数丛生竹种能够存活。孝顺竹(Bambusa multiplex)地下茎合轴丛生, 与多数仅能在我国华南地区生长的丛生竹种不同, 该竹种在我国亚热带混生竹区广泛分布, 引种到散生竹分布区如上海、浙江、南京等地生长良好, 具有较好的适应性和耐寒性。其纤维细长、制浆得率高, 适于制浆造纸。但孝顺竹秆茎细小, 产量较低, 竹笋的食用品质欠佳, 生产上通常作为小杂竹砍除, 导致对该资源的扩繁利用和保护受到局限。因此, 通过对孝顺竹开花生物学特性的研究, 并开展与大型优良笋材兼用丛生竹种麻竹(Dendrocalamus latiflorus)的杂交试验, 拟促进孝顺竹抗逆性和纤维品质方面的遗传基因与麻竹高产优质基因的遗传重组, 为竹类植物的新品种选育和重要性状的遗传分析提供材料。

1 材料与方法 1.1 试验材料

孝顺竹开花及杂交试验材料取自浙江省安吉竹种园自然开花的孝顺竹竹丛, 麻竹开花材料取自福建省南靖县麻竹试验林, 2008年春季将开花的孝顺竹和麻竹移栽至浙江省富阳市中国林业科学研究院亚热带林业研究所试验苗圃进行开花生物学观测并开展杂交试验。试验苗圃地理位置119°56'E, 30°5'N, 海拔50 m。属中亚热带东部季风气候区, 年降雨量1 300~1 500 mm, 最热月平均气温28.7 ℃, 最冷月平均气温3.6 ℃, 年均温16.1 ℃, 年均无霜期230天, 年平均相对湿度79%。土壤为山地红壤。

1.2 试验方法 1.2.1 开花生物学特性观测

自母竹移栽开始观测, 花序形成后做每日观测。小花开放后进行全日观测:自5:00—17:00观测小花开放情况、稃片张开程度、鳞被状态、柱头特征、花药长度、花丝长度、稃片闭合等习性, 每隔1 h观测1次。

1.2.2 花粉生活力检测

采用花粉粒萌发试验法:采集新鲜花药于室内通风放置, 自然散粉后取花粉撒于5 mg·L^-1硼酸+ 10%蔗糖培养基的载玻片上(张文燕等, 1990), 30 min后盖上盖玻片用Leica显微镜观察萌发情况, 统计萌发率(萌发花粉粒/总花粉粒× 100%)。根据花药不同发育状态分别采集10朵小花的花药, 混合散粉后检测, 每处理检测5次。

1.2.3 柱头可授性检测

用联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性(Dafni, 1992; 刘林德等, 2001):将不同发育阶段的柱头浸入含有联苯胺-过氧化氢反应液(质量分数1%的联苯胺:质量分数3%过氧化氢:水= 4: 11: 22, 体积比)的凹面载片中, 若柱头进入最佳可授期, 则柱头周围呈现蓝色并伴有大量气泡出现。对6:00之前开放的小花标记后, 在当日6:00—16:00每隔1 h检测10朵小花; 不同发育状态的小花每阶段取15朵, 在8:00—9:00进行检测。

1.2.4 自交、杂交试验

2008年7—8月, 采集麻竹花粉给孝顺竹授粉, 授粉小穗套袋隔离, 并对授粉小花作标记, 次日去掉套袋。利用同样技术开展孝顺竹、麻竹的种内授粉。待杂交和自交种实的稃片萎蔫枯黄即将脱落时采摘播种。杂交、自交种实播种于营养杯中, 营养杯口径12 cm, 每杯1粒, 覆土1 cm, 浇水保持湿润, 定期观测发芽、生长情况, 苗木稍大后移入较大的容器中培养。

1.2.5 杂交子代的苗期选择和杂种鉴定

以父本、母本的自交子代为对照, 在授粉群体中选择与母本自交苗差异较大的个体作为表型杂种, 按照无性系编号为H1, H2, H3……, 开展表型杂种与亲本自交子代的表型性状调查分析, 然后利用AFLP分子标记进行杂种鉴定和遗传分析。基因组DNA提取采用改良的CTAB法(Doyle et al., 1987)。用Eco Ⅰ和Mse Ⅰ双酶切模板DNA(900~1 000 ng)并与接头连接, 以带有1个选择性碱基的引物进行预扩增, 然后用带有3个选择性碱基的引物进行选择性扩增, 反应体系20 μL。PCR产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。根据迁移距离对AFLP位点读带, 有带记为“1”, 无带记为“0”, 应用NTSYS-pc 2.1软件(Rohlf, 2000)进行遗传距离计算和UPGMA聚类。筛选出的8对引物组合为EACT/ MCAT, ECTA/ MCTA, EAGC/ MCAC, EAAG/ MCTA, EAGC/ MCAA, ECTA/ MCAT, EAAC/ MCAG, EAAG/ MCAT。

2 结果与分析 2.1 孝顺竹的开花生物学特性

孝顺竹一般于4月份形成花序, 花序形成后10日左右个别小花开始开放。小花开放时, 子房基部的鳞被呈两瓣状膨大成晶状半球形, 外稃张开, 柱头和花药露出, 柱头3裂, 白色羽毛状; 花药6枚, 紫色略带红。稃片张开后花丝迅速伸长生长达8~15 mm, 花药长5~9 mm, 下垂, 3~4 h后花药颜色变褐。晴好天气小花在早晨4 : 00—5 : 00集中开放, 6: 00—8: 00仍有少量小花开放, 15 : 00左右鳞被逐渐失水呈膜状, 外稃闭合, 16 : 00—17 : 00全部闭合。在阴雨天气或者寒潮天气小花开放时间推迟, 可在中午至下午有少量小花开放。末级小穗常形成小花(5) 6~11(13)朵, 一般小穗基部前出叶上面第2朵最先开放, 或者第1朵与第2朵同日开放; 小穗上部相邻的小花次日开放, 或者到第3天开放; 每小穗常开花6~7(9)朵小花, 梢部2~3朵小花常不开放。每小穗完成开花的时间在10~12天左右。孝顺竹花期受天气影响较大, 温度较高的年份从3月下旬至4月上旬形成花序, 可持续至12月份。期间遇高温、多雨季节开花数量显著降低。

2.2 不同发育阶段孝顺竹花粉和柱头的生活力

孝顺竹花粉在不同发育阶段的萌发率如表 1所示。结果显示:花药未伸出稃片或微露出稃片时离体自然散粉时间长, 花粉无萌发或萌发率极低; 在花丝伸长生长结束即花药下垂时散粉最快(3~5 min), 花粉萌发率最高(35%~53%), 因此推测花药在花丝伸长生长结束时花粉发育成熟, 可以作为授粉材料。此时花丝细长柔弱, 花药下垂并且散粉从花药的下部开始开裂, 而柱头尚包被在稃片内或略伸出稃片, 这样就显著地减少了自花授粉的可能性, 可能是物种进化过程中避免自花授粉形成的。

对不同发育阶段的小花(稃片未张开、微张开、半张开、全张开)进行柱头可授性检测(表 2)。可以看出, 随着小花张开程度的提高, 联苯胺反应的信号增强, 表明在小花完全开放, 即稃片展开最大时柱头可授性最强, 推测此时进行授粉受精的可能性最大。

早晨(6:00前)开放的在当天不同时刻的柱头可授性(表 3)表明, 早晨开放的小花在9:00—12:00柱头可授性信号最强, 因此, 杂交育种和人工授粉选择于上午进行较为适宜。

2.3 孝顺竹自交、杂交试验及其子代的表型特征

孝顺竹种子为颖果, 长椭圆形, 有不甚明显的腹沟, 具喙, 成熟时黄褐色, 纯净种子长0.82~1.10 cm, 宽0.26~0.28 cm, 百粒鲜质量3.32 g。杂交种实未表现出与自交种实的明显区别。播种后4个月龄时, 通过杂交授粉获得的20株子代中有10株的表型与母本自交苗有明显差别, 特别是叶片明显大于后者, 故初步推测其为杂交种。图 1为孝顺竹、麻竹自交、杂交的种子及4个月龄的幼苗。

统计孝顺竹、麻竹自交子代及其表型杂种在4个月龄时的性状特征(表 4), 可以看出, 4个月龄时表型杂种的叶长、叶宽、叶长/宽、地径、发笋数、叶片形状、叶脉数、叶鞘高度、叶鞘繸毛、叶耳、叶舌等性状均介于母本自交子代与父本自交子代之间。株高大于双亲的自交子代, 叶色较双亲自交子代浓郁。

孝顺竹×麻竹杂交子代苗期生长旺盛, 15个月龄时秆直径可达3.3 cm, 高度可达4.0 m, 叶片长度、宽度分别可达33 cm和6.0 cm。此时, 杂种秆箨的刺毛性状在不同的无性系间初步表现出差别(图 2)。秆箨刺毛是竹子分类上常用的表型性状之一, 杂交试验的母本孝顺竹秆箨无毛, 而父本具棕色刺毛, 杂种秆箨的刺毛从表型上证实了杂种的真实性, 也为今后无性系的鉴别提供了参考。由于苗木年龄尚小, 性状的变异性有待于成年后进一步调查分析。

2.4 孝顺竹×麻竹杂种的AFLP鉴定与遗传位点分析

利用筛选出的双亲有遗传位点差异的8对引物用于孝顺竹、麻竹亲本及表型杂种的AFLP扩增(表 5), 可以看出:8对引物在10株表型杂种中扩增出的位点为531~543个, 其中父本特异位点118~152个, 占21.97%~28.10%, 表明引入了父本的遗传信息; 母本特异位点85~101, 占15.92%~18.70%;非亲本位点数较少, 为10~22个, 占1.88%~4.05%, 可能是由于遗传重组造成的。利用NTSYS-pc 2.1软件计算亲子12株个体间的遗传距离并进行UPGMA聚类(图 3), 可以看出, 10株杂种首先聚在一起(其中H3与H4, H7与H8的遗传距离最近), 然后分别与父本P2和母本P1相聚。

3 结论与讨论

杂交是传统育种和遗传学研究的基础方法。就竹类植物而言, 其特殊的开花特性较大地限制了杂交技术的实施(Kleinhenz et al., 2001; Lin et al., 2004)。迄今获得竹子杂种的报道屈指可数:张光楚等(1986)开展了麻竹、撑篙竹(B.pervariabilis)、版纳甜龙竹(D.hamiltonii)等竹种的杂交试验, 选育出撑麻(B.pervariabilis × D.latiflorus)、麻版(D.latiflorus × D.hamiltonii)等优良杂种无性系; 宁材强等(1995)利用撑篙竹和大绿竹(B.grandis)进行杂交, 选育出撑绿(B.pervariabilis × B.grandis)优良杂交无性系, 这些优良无性系适宜在我国南方、西南地区种植, 受冬季低温的影响北移的局限性较大。本试验选择耐寒性较强、分布广泛的孝顺竹为杂交亲本, 旨在通过与优良竹种的杂交试验进而选育在适应性、竹材品质等方面表现优良的无性系, 为竹业生产提供服务。开花生物学特性的研究表明, 孝顺竹花期较长, 在4—11月份均有开花; 柱头可授性好, 9: 00—13: 00柱头的联苯胺反应的信号最强; 花粉生活力高, 萌发率可达50%以上, 非常适宜作为杂交的亲本。

杂种的早期识别是杂交试验中较为关键的环节, 对于节约人力、物力、经费和试验场地等方面具有重要价值, 常用的杂种鉴定方法是表型性状鉴定与分子标记相结合(Kumar, 1999)。表型性状鉴别是识别杂种便捷有效方法之一, 本试验在开展杂交的同时也开展了种内自交试验, 这种利用自交和杂交苗对比的方法进行杂种的选择十分有效, 在4个月龄时即可通过表型差异初步筛选出杂交种, 极大地提高了杂种鉴定的效率。10株表型杂种在4个月龄时的叶长、叶宽、叶长/宽、地径、发笋数、叶片形状、叶脉数、叶鞘高度、叶鞘繸毛、叶耳、叶舌等性状均介于母本自交子代与父本自交子代之间。仅株高大于双亲的自交子代, 叶色较双亲自交子代更加浓郁。分子标记是进行杂种鉴定的现代工具之一, 如AFLP标记被成功应用于杨树(Populus ciliata × maximowiczii) (Chauhan et al., 2004)、香草(Vanilla planifolia × fragrans) (Divakaran et al., 2006)、甘蔗(Saccharum spp.) (Lima et al., 2002)等杂种的鉴定。本试验将AFLP标记用于孝顺竹×麻竹种间杂种的鉴定, 发现10株杂交竹引入的父本特异位点为21.97%~28.10%, 基于遗传距离的聚类分析表明10株杂种首先聚在一起, 然后分别与父本P2和母本P1相聚。由于获得的开花竹株有限, 且部分母竹在移栽后死亡, 所以未能开展反交试验, 在条件许可时应尽可能同时开展正交和反交试验。竹子与多数每年开花结实的林木不同, 一般在开花后死亡, 故而在开展杂交试验期间应注意保存亲本遗传材料或基因组DNA, 为将来杂种鉴定提供信息来源。

孝顺竹具有较多的优良特性, 是丛生竹中耐寒性最强的非高山竹种(江泽慧, 1996), 江苏沿海地区引种栽培表明孝顺竹较耐盐碱(楼崇, 2007), 台湾一些地区利用孝顺竹的抗风能力用作沿海防护林建设(许彩梁等, 2004); 同时孝顺竹也是传统的编织、造纸和绿化造景材料。尽管当前孝顺竹在竹业生产上未受重视, 但是随着研究的不断深入, 基于孝顺竹的杂交和再生体系的遗传改良技术平台逐渐建成(袁金玲等, 2009), 将促进对孝顺竹这一优良遗传资源的发掘利用, 为竹产业的发展提供新型种质材料。