全球的竹业已发展成为一个与约25亿人的生产生活密切相关、年产值近50亿美元的产业。竹林是我国南方山区经济价值高、经营面积广、经营强度大的森林类型之一，我国现有竹林520万hm²，其中毛竹(Phyllostachys edulis)超过350万hm² (第六次森林资源清查)。毛竹生长快、竹材利用前景好、经济效益高，深受山区农民欢迎，近年来许多天然林及杉木(Cunninghamia lanceolata)等速生林被毛竹替代，毛竹林面积不断扩大。目前，竹林生物多样性丧失、生产力下降和生态服务功能降低等现象逐渐显现，引起了相关组织和专家的重视(杨淑贞等，2008)。

土壤微生物群落是土壤生物区系中最重要的功能组分，是土壤养分循环的主要驱动者，也是土壤生物多样性的重要组成，在生态系统中起着重要作用。土壤微生物对所生存的微环境十分敏感，可对土地利用方式的改变以及人为干扰等做出反应(Sparling，1997; 杨永华等，2000)。土壤微生物群落结构特征可以通过微生物物种多样性、遗传多样性、生态特征多样性和功能多样性4个方面来概括(张薇等，2005)。

磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干质量的5%，只存在于活细胞膜中，一旦生物细胞死亡，其中的磷酯类化合物很快被降解。不同种类微生物体内磷脂类化合物中的磷脂脂肪酸(PLFA)组成及含量具有特异性，分析微生物PLFA含量和组成，是研究土壤微生物生物量及群落结构动态变化的有效方法(章家思，2004)。

本研究选取不同栽培历史的毛竹林，利用磷脂脂肪酸(PLFA)方法，研究毛竹纯林长期经营过程中土壤微生物生物量和群落结构的演变规律，探讨毛竹林的生态安全问题，为长期可持续经营毛竹林地提供理论依据。

浙江省杭州市桐庐县(119°10'—119°58'E，29°35'—30°05'N)位于浙江省西北部，地处钱塘江中游，属于典型中亚热带季风气候，四季分明，光照充足，温暖湿润。年均气温16.6℃，年均降水量1 462 mm。土壤母质为砂岩或粉砂岩。研究区内毛竹林由马尾松(Pinus massoniana)林改造而成，经营历史不同，最短5年，最长45年，竹林密度为1 800~2 550株·hm^-2，林下有灌木和蕨类植物。以粗放经营为主，不施用化肥，每年冬季劈山除去林下杂灌，每隔1年挖春笋、砍伐成熟竹材。

2006年12月，在研究区选择立地条件一致(坡度10°左右，坡向为西南方向)、有代表性的不同栽培历史的毛竹林样地5个，各样地面积约0.5~1 hm²，开始经营年份分别为2002，1996，1990，1980和1960年(分别标记为2002，1996，1990，1980和1960)，并设天然马尾松林(林下有多种阔叶的灌木)为对照样地(标记为PM)。在每个样地的山脚、山腰和山顶分别采集3个剖面0~20 cm表层土壤，混合组成对应的山脚、山腰和山顶样品，样品带回室内过2 mm钢筛后分成2份，1份鲜样用于土壤微生物磷脂脂肪酸分析，另1份风干后用于土壤理化性质测定(鲁如坤，1999)。6块样地土壤基本理化性质见表 1。

表 1 各样地土壤理化性质 Tab.1 Soil physicochemical property of the various sample plots

表 1 各样地土壤理化性质 Tab.1 Soil physicochemical property of the various sample plots

土壤微生物的PLFA提取参照Bligh-Dyer修正方法(Bossio et al., 1995)，酯化C19:0为内标，其提取、纯化、分析测定流程为:取相当于2 g干土质量的新鲜土壤或冻干土壤，加20 mL氯仿－甲醇－柠檬酸缓冲液(1:2:0.8，v /v /v)直接抽提样品的总PLFA; 提取的PLFA经硅胶柱(SPE-SI)分离为中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷酸脂。磷酸脂溶于甲醇/甲苯(1:1，v /v)溶液，然后加0.2 mol·L^-1 KOH，37℃酯化15 min后，用GC-MS(gas chromatograph-mass spectrometry)分析仪进行不同分子的分离，然后用PLFA标准谱图(bacterial fatty acid standards)和美国商品化的MIDI系统(microbial identification system)来识别与定量PLFA。得到土壤微生物PLFA剖面，经统计分析可以判断出土壤微生物群落结构多样性。PLFA命名及分类见文献(齐鸿雁等，2003; 于树等，2008; Marschner et al., 2005)。

PLFA绝对含量C (nmol·kg^-1)计算公式为:C = A_im_s/(A_s×m)，A_i为第i种PLFA组分的峰面积，A_s为内标的峰面积，m_s为内标的物质量，m为土壤样品干质量。PLFA相对百分比是第i种PLFA的峰面积占总峰面积的百分比。

PLFA是土壤微生物细胞膜的重要组成成分，PLFA总量与微生物生物量呈正相关，因此，PLFA总量能够对微生物生物量做出准确衡量(姚槐应等，2006); 不同种类微生物有自己独特的PLFA组成，PLFA种类的多少可以作为衡量土壤微生物多样性的指标，种类越多则微生物多样性越丰富(Xue et al., 2008)。从图 1可知:不同栽培历史表层土壤PLFA总量不同，但没有随着毛竹栽培历史的增加而呈现明显的规律性，其中种植5年毛竹(2002年刚改造竹林)的土壤PLFA总量最低，明显低于对照马尾松林(P＜0.05);其次为毛竹种植15年时(1990年竹林)，但其PLFA总量与对照马尾松林没有显著差异; 毛竹种植25年以后(1980和1960年)土壤微生物的PLFA总量已恢复到改种前的天然马尾松林水平。

图 1 不同栽培历史毛竹林土壤微生物磷脂脂肪酸总量 Figure 1 Total PLFA content of soil microbes in bamboo plantation with different cultivation time

从图 2可知:样地PM, 1990, 1980, 1996, 1960和2002的PLFA平均种类数依次为47.3，43.0，40.3，39.7，39.7，和38.3，马尾松林土壤PLFA种类最多，而新改造的竹林最低。同一样地3个重复土壤样品PLFA的总量和种类也存在较大差异，Xue等(2008)认为:PLFA种类与总量的综合信息更能反映微生物群落多样性，种类与总量之间有较好的相关性(DeGrood et al., 2005)。本研究所有土壤样品PLFA种类与总量的关系如图 2所示，整体上2者呈正相关，种类多的总量高; 如总量最高的马尾松林含有的PLFA种类最多，相反2002年种植的毛竹林土壤2者均为最低。分析同一样地3个重复土壤PLFA种类与总量之间的正相关关系发现，天然马尾松林最好; 2002年种植的毛竹林最差，其中山脚土壤样品脂肪种类达46种，接近天然马尾松林，而土壤PLFA总量则只有97.6 nmol·g^-1; 其他样地土壤居中。图 2可知:同一样地3个重复土壤的PLFA种类与总量差异均较大，一般山脚土壤样品高于山腰和山顶。

图 2 不同栽培历史毛竹林土壤微生物磷脂脂肪酸总量与种类数的关系 Figure 2 Relationship between number of PLFA types and tolal PLFA content of soil microbes in bamboo plantation with different cultivation time

PLFA组成不仅能反映微生物土壤微生物生物量与多样性，而且通过统计分析还可以揭示微生物群落组成差异以及微生物区系的变化动态(Zelles，1999)。选择多数样品能检测到的16种主要PLFA含量(nmol·kg^-1土壤)进行主成分分析，结果表明:第一主成分解释了73.65%的信息(图 3)，天然马尾松林土壤的第一主成分最大，2002年最小, 1996, 1990和1960年居中。不同种植时间的毛竹林在第二主成分上存在差异，种植时间长的相对大于短的，1990和1960年大于1996和2002年。由图 3可知:天然马尾松林土壤微生物群落组成与毛竹林有较大差异，不同种植时间的毛竹林之间差别不明显，呈渐变趋势。

图 3 不同栽培历史毛竹林土壤微生物群落PLFA主成分分析 Figure 3 Principle components analysis based on PLFA composition of soil microbes in bamboo plantation with different cultivation time

为了揭示引起微生物群落组成变化的主要因子，以16种PLFA含量(nmol·kg^-1土壤)为依据进行因子分析得到3个主因子，3个主因子的特征值依次为10.93，2.43和1.26，对应贡献率分别为68.3%，15.2%和7.90%，3个主因子的累计贡献率达91.35%。分析表 2(Zelles，1999)的因子载荷值发现，方差极大正交旋转前的16个变量的初始因子1载荷值中有8个变量的载荷值在0.9以上(表 2)，大部分也都在0.5以上，而16:1 2OH则在第2主因子上的载荷值明显大于其他变量，载荷值越大说明变量与主因子关系越密切。

表 2 不同土壤微生物磷脂脂肪酸的载荷值 Tab.2 Eigenvector loadings of different PLFA of soil microbes

表 2 不同土壤微生物磷脂脂肪酸的载荷值 Tab.2 Eigenvector loadings of different PLFA of soil microbes

为了进一步解释变量与主因子的关系，对因子矩阵进行方差极大正交旋转使结构简单化，不同变量的载荷值差距加大了，载荷值最大的变量是ai15:0(0.940 73)，载荷值0.85以上变量只有4个，分别是i15:0，ai15:0，18:1 w7c和cy19:0 w8c，这4个变量与主因子1相关性最好，对主因子1的贡献率最大，主因子1是它们的代表因子(于树等，2008); 放线菌的生物标记PLFAs 10Me18:0，10Me 16:0和10Me 17:0的载荷值接近0.8，对主因子1的贡献率也较大。为了解不同变量之间的相关关系，分别以方差极大正交旋转后主因子1和2的载荷值为横坐标和纵坐标得图 4，在坐标轴一侧的变量有较好的相关性，在图中相邻距离越短的变量之间相关性越好。结果表明:16:1 2OH位于横坐标上方，与其他变量的相关性差; 位于横坐标下方的15个变量中17:00和18:2 w6，9c离群较远，右侧的7个变量(i15:0，ai15:0，18:1 w7c，cy19:0 w8c，10Me18:0，10Me 16:0和10Me 17:0) 间的距离较近，相互间有密切的关系。

图 4 不同土壤微生物磷脂脂肪酸载荷图 Figure 4 Eigenvector loadings of different PLFAs of soil microbes

为揭示天然马尾松林改种毛竹林以及随毛竹种植时间增加土壤微生物群落组成的变化规律，以38种PLFA的相对百分比为基础进行聚类分析(图 5)。结果表明:同一样地3个重复样品基本相邻，种植时间相近的样地相邻。相聚的距离越小，微生物群落差异越小。由图 5可知，同一样地不同坡位3个土壤样品微生物群落组成的相似度高于不同样地之间; 随着毛竹种植时间增加，土壤微生物群落组成逐渐发生变化，毛竹种植15年(1990年竹林)后变幅缩小，25年后(1980年竹林)基本稳定。天然马尾松林与毛竹林土壤聚类的距离最大，2者的土壤微生物群落组成差异较大，相对而言，毛竹种植时间短的样地(2002年)土壤微生物群落组成与天然马尾松林差异较小。

图 5 不同栽培历史毛竹林土壤微生物磷脂脂肪酸聚类分析 Figure 5 Cluster analysis based on PLFA composition of soil microbes in bamboo plantation with different cultivation time

天然马尾松林改种毛竹后短期(5年)内微生物量和多样性下降，随着毛竹栽培历史的增加逐渐恢复，至25年时(1980年竹林)已恢复到改造前(马尾松林)水平，之后基本稳定。本试验采用PLFA方法的结果与王纪杰(2007)应用Biolg方法的研究结果一致。分析产生此研究结果的主要原因有二:一是地上植物种类发生变化(天然马尾松林改种毛竹后，地上植物多样性及生物量均发生变化，特别在短期内竹林下植物数量较少，而随着毛竹种植时间增加，地上植物的生物量、郁闭度和多样性增加); 二是因翻耕和地上植物的变化导致土壤环境改变，有机质分解加剧，土壤养分含量明显下降(表 1)，土壤微生物因此受到强烈影响，而随着毛竹种植时间的增加，土壤环境渐趋稳定，土壤微生物也逐渐恢复，其微生物PLFA含量及多样性逐渐提高。同一种植时间的毛竹林样地3个样品土壤微生物PLFA种类和总量差异的原因，主要是每个样地的3个重复分别采自山脚、山腰和山顶的不同坡位，土层厚度及养分状况存在差异，通常从山脚到山顶呈下降趋势。

以土壤微生物PLFA总量为基础的主成分分析和以PLFA的相对百分比为依据的聚类分析结果均表明，马尾松林与毛竹林土壤的微生物PLFA组成差异明显。改种初期毛竹林(2002年)样地土壤的微生物群落组成与马尾松的差异相对小于毛竹种植时间长的样地(1980和1960年)，是因为改种初期土壤有机质组成在短期内变化并不大，虽然土壤中有机质含量大幅下降(表 1)。其他研究证明，有机质的组成具有相对稳定性(Flessa et al., 2000)。随着毛竹栽培历史增加，虽然土壤有机质含量得到恢复，但由于地上植物的变化，土壤碳源种类逐渐发生变化，毛竹林土壤微生物的群落组成与原来马尾松土壤的差异性随毛竹种植时间增加，至25年以后则基本达到稳定状态，形成新的微生物区系。同一林地3个重复样品的相似度高于不同样地之间，进一步说明，土壤碳源种类对微生物群落组成的影响大于碳源含量。

在不施用化肥、翻耕而采用冬季劈山除林下杂灌这种粗放经营措施下，天然马尾松林改种毛竹林、并长期种植毛竹，土壤微生物量和多样性变化不大，但微生物区系结构发生了变化。可见，毛竹林纯林长期粗放经营的模式，不会引起土壤微生物多样性的显著下降，毛竹林生态系统的多样性较好，毛竹林可长期持续经营。为了进一步揭示毛竹林纯林长期粗放经营后土壤微生物群落组成的变化，建议开展土壤细菌、真菌以及特殊功能微生物的研究。