在线虫的生防研究中，第1代杀线生防制剂是直接利用菌体的活菌剂，由于土壤有不同程度的抑菌作用，导致这些杀线生防制剂在不同的土壤中施用效果不稳定(Ali et al., 2002)。为了克服这一难题，人们更加关注第2代线虫生防产品即菌株次生代谢产物的研究与开发，其内容主要包括对菌株次生代谢产物中杀线物质的分离、提纯和杀线机制的研究，对已分离纯化的杀线物质结构进行化学修饰，设计合成新化合物为生物杀线剂的研制提供研究思路。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) JK-JS3是一株从马尾松(Pinus massoniana)林中筛选的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的细菌(朱丽梅等，2008a; 2008b; 2009a)，已有研究表明该菌株菌体本身无杀线活性，其具有杀线活性的物质存在于培养滤液中，是一种非蛋白质物质，在碱性条件下具有杀线活性，对热具有较强的稳定性，石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂均不能将其从培养液中提取(朱丽梅等，2009b); 但该物质是否能应用于生产实践以及如何应用，首先须了解其结构。因此本文在已有研究的基础上，利用酸碱沉淀法对菌株JK-JS3的杀线粗提物分离提纯并通过气质联用的方法对其杀线活性物质的结构进行鉴定。

1 材料与方法 1.1 供试线虫和细菌菌株的培养

供试松材线虫分离自江苏连云港发病黑松(Pinus thunbergii)，保存于江苏省有害生物预防与控制重点实验室(南京林业大学)，线虫的培养及线虫悬液的制备方法参见文献(朱丽梅等，2008a)。

供试解淀粉芽孢杆菌JK-JS3菌株分离自南京紫金山马尾松松针，保存于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上。

JK-JS3菌株接种液的制备:将JK-JS3菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基的试管斜面中，培养10 h后再移接至新的斜面上，重复此步骤2~3次，保证菌株充分活化。将活化后的JK-JS3菌株接种到事先配好的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以120 r·min^-1转速振荡培养24 h使用，接种前菌体的浓度调至1.6 × 10⁸·mL^-1。

细菌培养液和滤液的制备参见文献(朱丽梅等，2008a)。

1.2 菌株JK-JS3杀线活性物质的分离

本试验采用酸碱沉淀法对其成分逐步分离纯化。已有研究表明菌株JK-JS3所分泌的杀线活性物质在碱性条件具有杀线活性(朱丽梅等，2008b)，因此对每步骤分离的物质均将其pH值调节至与培养10天的该细菌培养滤液的pH (pH = 8)一致，测定其对松材线虫的杀线活性。首先将细菌培养滤液(pH = 8)用1 mol·L^-1浓度的盐酸调节pH至酸性，部分碱性的物质与酸形成了不溶解的白色沉淀物，于4 000 r·min^-1条件下离心5 min，将培养液分为白色沉淀物①和上清液②部分。将所获得的白色沉淀物①置于小烧杯中，加水溶解后用1 mol·L^-1浓度的NaOH调节至pH = 8，分别测定沉淀的溶解物和上清液对松材线虫的毒杀活性。

将上清液②用旋转蒸发仪在60 ℃下旋转蒸发，分别得到蒸出液④和残余液⑤。经测定，蒸出液④的pH为3.96，残余液⑤的pH为1.6，分别调节蒸出液④和残余液⑤的pH至8，测定杀线活性。剩余残余液⑤调节pH至8后用旋转蒸发仪在60 ℃下旋转至干，得蒸出液⑥和残余液⑦。残余液⑦加蒸馏水稀释至原体积后，分别测定蒸出液⑥和残余物⑦水溶液对松材杀虫的杀线活性，以新鲜培养液滤液为对照，测定方法参见文献(朱丽梅等，2008a)。

1.3 菌株JK-JS3杀线物质的气质联用分析

将1.2中分离提取的物质，经生测具有明显杀线活性的提取物用安捷伦气相色谱-质谱联用仪进行杀线物质的分离和结构分析，对照为新鲜培养液按1.2中操作所获的最终蒸出液。

1.3.1 仪器

安捷伦气相色谱-质谱联用仪(Agilent，6890-5973N)

1.3.2 色谱条件

色谱柱为HP-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)石英毛细管柱。接口温度: 280 ℃; 离源温度: 230 ℃; 四极杆温度: 150 ℃。进样量1 μL; 流量1.4 mL·S^-1，不分流进样; 载气:氦气。色谱柱升温程序: 70 ℃保持2 min，然后以25 ℃·min^-1程序升温至150 ℃，以3 ℃·min^-1升温至200 ℃，再以8 ℃·min^-1升温至280 ℃。全扫描离子检测。质谱数据库: NIST数据库。

2 结果分析 2.1 菌株JK-JS3培养液分离提取物对松材线虫杀线活性的测定

细菌JK-JS3培养液经酸碱沉淀分离后获得白色沉淀物和上清液，将白色沉淀物和上清液分别测试对松材线虫的杀线活性，结果表明上清液②调至pH = 8时对松材线虫有高的杀线活性，活性级别为“ + + + + ”，而白色沉淀经溶解后测试无杀线活性，活性级别为“-”。说明经过第1步分离后杀线物质存在于上清液②中。将上清液②通过60 ℃减压旋转蒸发分离为2个组分蒸出液④和残余液⑤，通过生测发现，蒸出液④无杀线活性，而残余液⑤的pH被调节至8，其杀线活性级别为“ + + + + ”，残余液⑤再经60 ℃减压旋转蒸发分别获得蒸出液⑥和残余物⑦，经生测后发现蒸出液⑥具有较强的杀线活性，活性级别为“ + + + + ”，而残余液⑦经水溶解后无杀线活性(表 1)，说明细菌JK-JS3培养液经逐步分离后，杀线物质最终存在于蒸出液⑥中。

2.2 菌株JK-JS3杀线物质的气质联用分析

JK-JS3培养液蒸出液⑥和对照新鲜培养液蒸出液经安捷伦气相色谱1质谱仪进行分析后，其总离子图如图 1，2所示，与对照相比，JK-JS3培养液蒸出液⑥在3.15，3.41，3.58，3.83，4.84和5.17 min等处均有物质出峰。

经解析与NIST标准图谱对照，共鉴定出3种化合物，结果见下表 2，其质谱图和结构图如图 3~5所示。

其中化合物1的保留时间为3.15 min，经质谱分析为Hexahydro-5-methyl-1-phenyl-1，3，5-triazine-2-thione，化合物名称为5-甲基-1-苯基-6H-1，3，5-三嗪-2-硫酮，CAS number 50978-86-4;化合物3的保留时间为3.41 min，峰结构解析为2，2-dimethyl-N-phenylpropanethioamide，化合物名称为2，2-二甲基-N-苯丙硫代酰胺，硫代酰胺类化合物，CAS number 5260-00-4;化合物4的保留时间为3.83 min，峰经质谱分析为Semiarbazide，4-(1，7，7-trimethylbicyclo[2.2.1]hepty1-2-ideno)-，化合物名称为樟脑醛缩氨脲，CAS number为10281-41-1，对上述3个化合物在SciFinder数据库中检索相关的专利和文献，均没有杀松材线虫活性的报道。

3 结论与讨论

本研究通过酸碱沉淀法分离提纯了解淀粉芽孢杆菌JK-JS3菌株的杀线粗提物，获得了具有杀松材线虫活性的水溶液，通过安捷伦气相色谱-质谱联用仪分析，经解析鉴定了3个化合物，3个化合物分别为5-甲基-1-苯基-6H-1，3，5-三嗪-2-硫酮，CAS number 50978-86-4; 2，2-二甲基-N-苯丙硫代酰胺，CAS number为5260-00-4和樟脑醛缩氨脲，CAS number为10281-41-1。3个化合物分别在SciFinder数据库中进行了专利和文献查新，以上化合物均没发现有杀松材线虫活性的报道。

天然毒素的化学结构与杀线活性密切相关，探讨其结构与性能的关系，可为开发高效生物农药提供理论依据。越来越多的学者认识到，研究杀线物质的结构与该物质生物活性之间的关系不仅具有理论意义，而且对于寻找活性更强的天然化合物，指导合成高活性的新化合物，以及通过对天然化合物进行化学修饰，从而提高其生物活性具有极大的实用意义。已有关于杀线微生物代谢产物的研究，应用最成功的是链霉菌分泌的阿维菌素，研究较多的是杀线虫真菌代谢产物(Stadler et al., 1993a; 1993b; 1995)，目前已初步研究过50多株杀线虫真菌的代谢产物并从中获得了具有毒杀线虫的活性代谢产物96个(丹阳等，2004; 董锦艳等，2005)。虽然杀线虫真菌的资源丰富，已有许多研究基础并具有开发应用的前景，但尚未有关真菌毒素能够大规模生产与应用的报道。近年来国内外也发现了多株具有杀线活性的细菌(Ali et al., 2002; Siddiqui et al., 2006; Zaki et al., 1991; Huang et al., 2005)，并对这些菌株的杀线机制做了较为系统的研究。Ali等(2002)筛选铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) strain-78对爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)二龄幼虫有明显的杀线活性，对该菌株的活性物质进行了初步的分析，发现该物质是热不稳定的，对酸碱敏感、有极性并且相对分子质量小于8 000。但与杀线真菌代谢产物的研究相比，杀线细菌代谢物的研究较少，尤其在国内尚没见到这方面的详细的研究报道。本研究首次报道了解淀粉芽孢杆菌JK-JS3菌株分泌的具有杀松材线虫活性的代谢产物以及化学结构，但目前对这些化合物在毒杀松材线虫中的作用机制尚未进行深入的研究，对于它们的杀线活性是单个化合物的作用还是3个化合物的共同作用，还需进一步研究。此外对于杀线活性物质产生的遗传背景，结构与杀线活性的关系，杀线机制以及杀线作用的稳定性，持久性和针对性等复杂问题均有待深入的研究。