文章信息
- 胡小燕, 陈莉, 辛海波, 连青龙, 义鸣放
- Hu Xiaoyan, Chen Li, Xin Haibo, Lian Qinglong, Yi Mingfang
- 唐菖蒲2种主要病毒的多重RT-PCR检测
- Detection of Two Viruses of Gladiolus hybridus by Multiplex RT-PCR
- 林业科学, 2011, 47(7): 128-132.
- Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(7): 128-132.
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文章历史
- 收稿日期:2009-12-11
- 修回日期:2010-03-09
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唐菖蒲(Gladiolus hybridus)是鸢尾科唐菖蒲属多年生球茎类草本植物,世界著名的四大切花之一。唐菖蒲主要依靠小籽球无性繁殖,这使植物体内逐渐积累大量病毒,导致植株茎叶萎缩、根部腐烂、花朵变形、杂色,严重影响了观赏价值,是造成唐菖蒲种性退化的主要原因。迄今为止,在全世界已发现的侵染唐菖蒲的病毒有10多种,其中黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)在我国是常见侵染且分布较广的2种主要病毒(刘丹红等,1994)。因此,建立高效灵敏的唐菖蒲病毒检测方法,对种球出入境检疫、脱毒苗检测具有重要意义。
用于检测唐菖蒲病毒的方法主要有生物法、血清法、电镜法和RT-PCR技术等,其中生物法检测周期长,电镜技术依赖大型精密仪器且操作要求严格,血清法抗血清成本高且灵敏度低,在病毒检测时均具有一定的局限性。近年来,RT-PCR技术因灵敏、快速、特异等优点已被广泛应用到唐菖蒲病毒检测中,其中多重RT-PCR技术能在一个反应体系中同时检测多种病毒,比单重RT-PCR更经济、更高效。病毒分子检测过程中,常因模板、酶等反应物的干扰出现假阴性的情况,运用内参照可有效解决假阴性的问题,提高检测结果的可信度(王冲等,2006)。目前,未见国内外利用内参照对CMV和TMV 2种唐菖蒲主要病毒进行多重RT-PCR检测的报道。本文以唐菖蒲的18S rRNA为内参照,对CMV和TMV的多重RT-PCR检测技术进行了研究,建立了唐菖蒲2种主要病毒的分子鉴定方法。
1 材料与方法 1.1 材料唐菖蒲品种‘Advanced Red'种球直径2.5 ~3.0 cm,籽球直径0.6~0.8 cm,购自辽宁金城试验基地。2008年4月种球种植于中国农业大学科学园试验地,2008年10月采收具有CMV、TMV明显症状的唐菖蒲籽球,以籽球离体培养获得的试管苗作为阳性材料,以健康唐菖蒲籽球试管苗作为阴性对照材料。
通过籽球茎尖培养获得的唐菖蒲组培苗保存于三角瓶中。
1.2 方法 1.2.1 引物设计根据NCBI Genbank中登录的唐菖蒲18S rRNA和CMV、TMV病毒外壳蛋白(CP)的基因序列,应用Primer Premier 5.0软件分别设计18S rRNA和2种病毒的特异引物,引物核酸序列见表 1。
取0.1 g唐菖蒲叶片在液氮中研磨,根据Invitrogen公司Trizol试剂说明,提取总RNA,最后用20 μL RNase free ddH2O溶解总RNA。
1.2.3 单重RT-PCR在离心管中加入14.5 μL总RNA和0.5 μL特异下游引物(CR1、TR1或SR,100 μmol·L-1),70 ℃变性5 min,取出冰浴2 min; 加入5 × M-MLV buffer 5 μL,10 mmol·L-1 dNTPs 1.25 μL,40 U·μL-1 RNasin Inhibitor 0.625 μL,200 U·μL-1 M-MLV反转录酶1 μL,加RNase free ddH2O补足至总体积25 μL。42 ℃ 1h,70 ℃ 15 min,合成cDNA。
PCR扩增体系为: cDNA1 μL,10 μmol·L-1上下游引物各1 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL,10 × PCR buffer 2.5 μL,5 U·μL-1 Taq酶0.2 μL,加ddH2O补足至25 μL。反应程序:预变性5 min; 94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环; 72 ℃延伸10 min,4 ℃终止反应。取10 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,利用BioRad凝胶成像系统观察结果。
1.2.4 多重RT-PCR多重RT反应体系:同时加入CR1、TR1和SR特异下游引物各0.5 μL至同一PCR管,其他条件与单重RT相同。
将3对引物(SF/SR、TF1/TR1、CF3/CR1,10 μmol·L-1)加入同一PCR管,各引物浓度组合见表 2。对多重RT-PCR的反应体系和反应程序进行优化,筛选合适的多重RT-PCR反应模式。
RT-PCR扩增产物用百泰克回收试剂盒回收纯化,与TaKaRa pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取白色菌落经PCR鉴定获取阳性克隆,送奥科生物公司进行测序,测序结果利用NCBI Blast和DNAMAN软件进行同源性比较。
1.2.6 利用多重RT-PCR检测唐菖蒲脱毒苗利用已建立的多重RT-PCR体系对随机抽样的10株唐菖蒲茎尖组培脱毒苗进行病毒检测,并用单重RT-PCR方法进行验证。
2 结果与分析 2.1 单重RT-PCR检测及多重RT-PCR引物筛选唐菖蒲总RNA经反转录后PCR扩增的电泳结果表明:引物对SF/SR能扩增出与预期大小一致的18S rRNA基因片段,适合用作唐菖蒲病毒检测的内参照; 引物对TF1/TR1和TF2/TR1能从染病植株中扩增出TMV的特异片段; 引物对CF1/CR1、CF2/CR1、CF3/CR1能扩增出CMV的特异片段,而CF2/CR2除了扩增出CMV的特异片段之外还出现非特异性扩增产物; 设置的阴性对照没有对应的目的条带(图 1)。引物对TF1/TR1、TF2/TR1和CF1/CR1、CF2/CR1、CF3/CR1可分别用于单重RT-PCR检测唐菖蒲TMV和CMV病毒。
利用软件DNAMAN检测引物间的互补性及引物退火温度,引物对CF1/CR1、CF1/CR2、CF2/TR1、TF2/CR2、CF3/CR2存在较强的互补性,不适合用于多重PCR引物组合。引物对SF/SR、TF1/TR1、CF3/CR1退火温度接近,且扩增的目的片段大小有明显差异,易于区分。因此,选择SF/SR、TF1/TR1、CF3/CR1作为多重RT-PCR的引物。
2.2 多重RT-PCR检测以18S rRNA作为内参照,通过双重、三重RTPCR分别可从带有TMV和CMV病毒的唐菖蒲叶片中扩增出1条或2条特异的病毒片段,健康叶片则仅扩增内参照片段,均未出现非特异性扩增产物(图 2)。
通过不同引物浓度组合进行多重扩增,结果显示,相同浓度的引物进行多重扩增时,内参照的扩增片段最亮,长片段的CMV扩增片段较弱(图 3)。这是因为引物存在竞争性扩增,内参照片段短较易扩增,且内参照模板量高于病毒模板量。对引物浓度进行调节,增加CMV的引物浓度,并降低内参照的引物浓度,得到最佳引物浓度组合为SF/SR 0.2 μmol·L-1、TF1/TR1 0.2 μmol · L-1、CF3/CR1 0.4 μmol·L-1。
经过多重RT-PCR的优化,发现提高长片段CMV的引物浓度、增加延伸时间有利于多重PCR扩增。试验得到最佳反应体系为: cDNA 2 μL,内参照引物SF/SR各0.5 μL,TMV引物TF1/TR1各0.5 μL,CMV引物CF3/CR1各1 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 4 μL,10 × PCR buffer2.5 μL,5 U·μL-1 Taq酶0.5 μL,加ddH2O补足至25 μL。扩增程序: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30个循环; 72 ℃延伸10 min。
2.4 RT-PCR产物序列分析对扩增产物回收并测序,结果显示CMV经引物对CF3/CR1扩增的片段为629 bp,与预期的产物大小一致,通过与GeneBank中其他植物的CMV分离物序列比对发现,本试验得到的CMV CP基因序列与日本六出花分离物(GeneBank No. AB261173)同源性为93%,与台湾香蕉分离物(GeneBank No. EU329016)同源性达97% (图 4)。TMV经引物对TF1/TR1扩增的片段为423 bp,与预期的产物大小一致,与西班牙烟草分离物(GeneBank No. AJ509083)和韩国凤仙花分离物(GeneBank No. AB354955)等同源性高达99% (图 5)。这2种病毒的CP基因是高度保守的。本试验建立的唐菖蒲CMV和TMV多重RT-PCR体系检测结果可靠,试验设计的病毒引物也具有广泛适用性。
利用多重RT-PCR方法对10株经茎尖脱毒处理的唐菖蒲组培苗进行检测。结果表明: 2株组培苗未脱除CMV,3株组培苗未脱除TMV(图 6)。运用单重RT-PCR验证,结果一致。证明了本试验建立的多重RT-PCR方法适用于脱毒苗的检测。
多重RT反应中引物可采用3种形式: Oligo (dT)、随机引物和特异引物。Oligo (dT)引物与RNA3'端Poly_(A)加尾结合,可用其检测带Poly _ (A)的病毒(Nie et al., 2000; 肖远辉等,2007)。随机引物会合成大量植物cDNA,干扰病毒cDNA合成效率。特异引物则有针对的合成病毒cDNA,提高了cDNA模板的纯度,减少了非特异模板的干扰(Katoch et al., 2002)。本研究的预试验中使用Oligo(dT)引物均未扩增出病毒条带,可能是因为CMV和TMV 2种病毒均不具有Poly_(A)尾,不适合用Oligo(dT)进行反转录。而采用2种病毒特异引物反转录得到的cDNA质量高,有利于后续PCR扩增。
在多重RT-PCR检测时因受到模板、酶等反应物的干扰,检测结果常出现假阴性。已有报道运用NADH脱氢酶nad5基因和mRNA作为内参照防止假阴性,提高检测结果的可靠性(牛建新等,2006; Menzel et al., 2002; Thompson et al., 2003)。在唐菖蒲中运用内参照检测病毒还未见报道。18S rRNA在植物体中含量很高,半衰期比mRNA长,周年存在于植物体内。本研究选用唐菖蒲18S rRNA作内参照,稳定地扩增出内参片段,这一内参同样适用于唐菖蒲其他病毒的检测。
多重PCR在同一反应中进行多个位点的特异扩增,引物间的配对、引物间的竞争性扩增等均影响扩增效果(黄银花等,2003)。本试验在选择多重扩增引物时避免了引物间、引物和其他模板间的互补配对,未产生非特异性扩增的干扰。筛选得到的引物Tm值较接近,保证了在相同的反应程序中均得到扩增。试验得到的扩增片段大小有一定差异,有利于电泳时区分产物。
据报道,国内外利用单重RT-PCR技术已成功检测了唐菖蒲上的多种病毒(Raj et al., 1998, 2002; 丁元明等,2008)。本研究建立了多重RTPCR检测体系并对扩增程序进行了优化,同时检测了两种病毒,简化了操作程序,比单重RT-PCR更经济、更高效。田间栽培的唐菖蒲往往受多种病毒的复合侵染,因此多重PCR方法有更广阔的应用前景。
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