林业科学  2011, Vol. 47 Issue (7): 128-132   PDF    
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胡小燕, 陈莉, 辛海波, 连青龙, 义鸣放
Hu Xiaoyan, Chen Li, Xin Haibo, Lian Qinglong, Yi Mingfang
唐菖蒲2种主要病毒的多重RT-PCR检测
Detection of Two Viruses of Gladiolus hybridus by Multiplex RT-PCR
林业科学, 2011, 47(7): 128-132.
Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(7): 128-132.

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收稿日期:2009-12-11
修回日期:2010-03-09

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胡小燕
陈莉
辛海波
连青龙
义鸣放

唐菖蒲2种主要病毒的多重RT-PCR检测
胡小燕, 陈莉, 辛海波, 连青龙, 义鸣放    
中国农业大学观赏园艺与园林系 北京 100193
摘要: 根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629 bp)和TMV(423 bp) 2条特异片段。测序结果表明: CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%~97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。
关键词:唐菖蒲    多重RT-PCR    黄瓜花叶病毒    烟草花叶病毒    18S rRNA    
Detection of Two Viruses of Gladiolus hybridus by Multiplex RT-PCR
Hu Xiaoyan, Chen Li, Xin Haibo, Lian Qinglong, Yi Mingfang    
Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture, China Agricultural University Beijing 100193
Abstract: Specific primer pairs were designed according to the gene sequence of cucumber mosaic virus (CMV) and tobacco mosaic virus(TMV) coat protein region. The two viruses could be detected by simple RT-PCR with the primers and the suitable primers were selected for multiplex RT-PCR. Using 18S rRNA of gladiolus as an internal control, a multiplex RT-PCR program was established to simultaneously detect the two viruses of Gladiolus hybridus. Two specific bands, CMV(629 bp) and TMV(423 bp) were amplified from all the samples infected with CMV and TMV by the multiplex RT-PCR. Sequence analysis of the amplified products showed that the nucleotide sequences homology of CMV and TMV was 93%~97% and 99%, respectively, compared with the sequences of other isolates.
Key words: Gladiolus hybridus    Multiplex RT-PCR    CMV    TMV    18S rRNA    

唐菖蒲(Gladiolus hybridus)是鸢尾科唐菖蒲属多年生球茎类草本植物,世界著名的四大切花之一。唐菖蒲主要依靠小籽球无性繁殖,这使植物体内逐渐积累大量病毒,导致植株茎叶萎缩、根部腐烂、花朵变形、杂色,严重影响了观赏价值,是造成唐菖蒲种性退化的主要原因。迄今为止,在全世界已发现的侵染唐菖蒲的病毒有10多种,其中黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)在我国是常见侵染且分布较广的2种主要病毒(刘丹红等,1994)。因此,建立高效灵敏的唐菖蒲病毒检测方法,对种球出入境检疫、脱毒苗检测具有重要意义。

用于检测唐菖蒲病毒的方法主要有生物法、血清法、电镜法和RT-PCR技术等,其中生物法检测周期长,电镜技术依赖大型精密仪器且操作要求严格,血清法抗血清成本高且灵敏度低,在病毒检测时均具有一定的局限性。近年来,RT-PCR技术因灵敏、快速、特异等优点已被广泛应用到唐菖蒲病毒检测中,其中多重RT-PCR技术能在一个反应体系中同时检测多种病毒,比单重RT-PCR更经济、更高效。病毒分子检测过程中,常因模板、酶等反应物的干扰出现假阴性的情况,运用内参照可有效解决假阴性的问题,提高检测结果的可信度(王冲等,2006)。目前,未见国内外利用内参照对CMV和TMV 2种唐菖蒲主要病毒进行多重RT-PCR检测的报道。本文以唐菖蒲的18S rRNA为内参照,对CMV和TMV的多重RT-PCR检测技术进行了研究,建立了唐菖蒲2种主要病毒的分子鉴定方法。

1 材料与方法 1.1 材料

唐菖蒲品种‘Advanced Red'种球直径2.5 ~3.0 cm,籽球直径0.6~0.8 cm,购自辽宁金城试验基地。2008年4月种球种植于中国农业大学科学园试验地,2008年10月采收具有CMV、TMV明显症状的唐菖蒲籽球,以籽球离体培养获得的试管苗作为阳性材料,以健康唐菖蒲籽球试管苗作为阴性对照材料。

通过籽球茎尖培养获得的唐菖蒲组培苗保存于三角瓶中。

1.2 方法 1.2.1 引物设计

根据NCBI Genbank中登录的唐菖蒲18S rRNA和CMV、TMV病毒外壳蛋白(CP)的基因序列,应用Primer Premier 5.0软件分别设计18S rRNA和2种病毒的特异引物,引物核酸序列见表 1

表 1 RT-PCR特异引物 Tab.1 Specific primers for RT-PCR
1.2.2 总RNA的提取

取0.1 g唐菖蒲叶片在液氮中研磨,根据Invitrogen公司Trizol试剂说明,提取总RNA,最后用20 μL RNase free ddH2O溶解总RNA。

1.2.3 单重RT-PCR

在离心管中加入14.5 μL总RNA和0.5 μL特异下游引物(CR1、TR1或SR,100 μmol·L-1),70 ℃变性5 min,取出冰浴2 min; 加入5 × M-MLV buffer 5 μL,10 mmol·L-1 dNTPs 1.25 μL,40 U·μL-1 RNasin Inhibitor 0.625 μL,200 U·μL-1 M-MLV反转录酶1 μL,加RNase free ddH2O补足至总体积25 μL。42 ℃ 1h,70 ℃ 15 min,合成cDNA。

PCR扩增体系为: cDNA1 μL,10 μmol·L-1上下游引物各1 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL,10 × PCR buffer 2.5 μL,5 U·μL-1 Taq酶0.2 μL,加ddH2O补足至25 μL。反应程序:预变性5 min; 94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环; 72 ℃延伸10 min,4 ℃终止反应。取10 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,利用BioRad凝胶成像系统观察结果。

1.2.4 多重RT-PCR

多重RT反应体系:同时加入CR1、TR1和SR特异下游引物各0.5 μL至同一PCR管,其他条件与单重RT相同。

将3对引物(SF/SR、TF1/TR1、CF3/CR1,10 μmol·L-1)加入同一PCR管,各引物浓度组合见表 2。对多重RT-PCR的反应体系和反应程序进行优化,筛选合适的多重RT-PCR反应模式。

表 2 多重RT-PCR引物浓度组合 Tab.2 Combinations of prime concentration in multiplex RT-PCR
1.2.5 RT-PCR产物的回收、验证和测序

RT-PCR扩增产物用百泰克回收试剂盒回收纯化,与TaKaRa pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取白色菌落经PCR鉴定获取阳性克隆,送奥科生物公司进行测序,测序结果利用NCBI Blast和DNAMAN软件进行同源性比较。

1.2.6 利用多重RT-PCR检测唐菖蒲脱毒苗

利用已建立的多重RT-PCR体系对随机抽样的10株唐菖蒲茎尖组培脱毒苗进行病毒检测,并用单重RT-PCR方法进行验证。

2 结果与分析 2.1 单重RT-PCR检测及多重RT-PCR引物筛选

唐菖蒲总RNA经反转录后PCR扩增的电泳结果表明:引物对SF/SR能扩增出与预期大小一致的18S rRNA基因片段,适合用作唐菖蒲病毒检测的内参照; 引物对TF1/TR1和TF2/TR1能从染病植株中扩增出TMV的特异片段; 引物对CF1/CR1、CF2/CR1、CF3/CR1能扩增出CMV的特异片段,而CF2/CR2除了扩增出CMV的特异片段之外还出现非特异性扩增产物; 设置的阴性对照没有对应的目的条带(图 1)。引物对TF1/TR1、TF2/TR1和CF1/CR1、CF2/CR1、CF3/CR1可分别用于单重RT-PCR检测唐菖蒲TMV和CMV病毒。

图 1 单重RT-PCR扩增结果 Figure 1 Amplified results of single RT-PCR M: DNA分子标记DL2000 Maker DL2000; 1:引物对SF/SR扩增内参Amplification of internal control by SF/SR; 2-3:引物对TF1/TR1、TF2/TR1扩增TMV Amplification of TMV by TF1/TR1,TF2/TR1; 4-7:引物对CF1/CR1、CF2/CR2、CF2/CR1和CF3/CR1扩增CMV Amplification of CMV by CF1/CR1,CF2/CR2,CF2/CR1 and CF3/CR1; 8:阴性对照Negative sample.

利用软件DNAMAN检测引物间的互补性及引物退火温度,引物对CF1/CR1、CF1/CR2、CF2/TR1、TF2/CR2、CF3/CR2存在较强的互补性,不适合用于多重PCR引物组合。引物对SF/SR、TF1/TR1、CF3/CR1退火温度接近,且扩增的目的片段大小有明显差异,易于区分。因此,选择SF/SR、TF1/TR1、CF3/CR1作为多重RT-PCR的引物。

2.2 多重RT-PCR检测

以18S rRNA作为内参照,通过双重、三重RTPCR分别可从带有TMV和CMV病毒的唐菖蒲叶片中扩增出1条或2条特异的病毒片段,健康叶片则仅扩增内参照片段,均未出现非特异性扩增产物(图 2)。

图 2 多重RT-PCR特异性扩增结果 Figure 2 Specificity amplified results of multiplex RT-PCR M: DNA分子标记DL2000 Maker DL2000; 1:健康叶片扩增18S rRNA Amplication of 18S rRNA from healfhy leaves; 2:双重扩增18S rRNA和TMV Double amplication of 18S rRNA and TMV; 3:双重扩增18S rRNA和CMV Double amplication of 18S rRNA and CMV; 4:三重扩增18S rRNA,TMV和CMV Triplex amplication of 18S rRNA,TMV and CMV.
2.3 多重RT-PCR优化体系的建立

通过不同引物浓度组合进行多重扩增,结果显示,相同浓度的引物进行多重扩增时,内参照的扩增片段最亮,长片段的CMV扩增片段较弱(图 3)。这是因为引物存在竞争性扩增,内参照片段短较易扩增,且内参照模板量高于病毒模板量。对引物浓度进行调节,增加CMV的引物浓度,并降低内参照的引物浓度,得到最佳引物浓度组合为SF/SR 0.2 μmol·L-1、TF1/TR1 0.2 μmol · L-1、CF3/CR1 0.4 μmol·L-1

图 3 不同引物浓度组合的多重RT-PCR扩增结果 Figure 3 Multiplex RT-PCR amplified results using different combinations of primer concentration M: DNA分子标记DL2000 Maker DL2000; 1: SF/SR 0.1μmol· L-1,TF1/TR1 0.2 μmol·L-1,CF3/CR1 0.4 μmol·L-1; 2: SF/SR 0.1μmol·L-1,TF1/TR1 0.4 μmol·L-1,CF3/CR1 0.2 μmol·L-1; 3: SF/SR 0.2 μmol·L-1,TF1/TR1 0.2 μmol·L-1,CF3/CR1 0.4 μmol·L-1; 4: SF/SR 0.2 μmol·L-1,TF1/TR1 0.2 μmol·L-1,CF3/CR1 0.2 μmol·L-1; 5: SF/SR 0.2 μmol·L-1,TF1/TR1 0.4 μmol·L-1,CF3/CR1 0.2 μmol·L-1; 6: SF/SR 0.4 μmol·L-1,TF1/TR1 0.4 μmol·L-1,CF3/CR1 0.4 μmol·L-1.

经过多重RT-PCR的优化,发现提高长片段CMV的引物浓度、增加延伸时间有利于多重PCR扩增。试验得到最佳反应体系为: cDNA 2 μL,内参照引物SF/SR各0.5 μL,TMV引物TF1/TR1各0.5 μL,CMV引物CF3/CR1各1 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 4 μL,10 × PCR buffer2.5 μL,5 U·μL-1 Taq酶0.5 μL,加ddH2O补足至25 μL。扩增程序: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30个循环; 72 ℃延伸10 min。

2.4 RT-PCR产物序列分析

对扩增产物回收并测序,结果显示CMV经引物对CF3/CR1扩增的片段为629 bp,与预期的产物大小一致,通过与GeneBank中其他植物的CMV分离物序列比对发现,本试验得到的CMV CP基因序列与日本六出花分离物(GeneBank No. AB261173)同源性为93%,与台湾香蕉分离物(GeneBank No. EU329016)同源性达97% (图 4)。TMV经引物对TF1/TR1扩增的片段为423 bp,与预期的产物大小一致,与西班牙烟草分离物(GeneBank No. AJ509083)和韩国凤仙花分离物(GeneBank No. AB354955)等同源性高达99% (图 5)。这2种病毒的CP基因是高度保守的。本试验建立的唐菖蒲CMV和TMV多重RT-PCR体系检测结果可靠,试验设计的病毒引物也具有广泛适用性。

图 4 唐菖蒲CMV扩增片段与其他植物CMV分离物核苷酸序列的同源性比较 Figure 4 The homology comparison of nucleotide acid sequences of CMV among Gladiolus and other isolates
图 5 唐菖蒲TMV扩增片段与其他植物TMV分离物核苷酸序列的同源性比较 Figure 5 The homology comparison of nucleotide acid sequences of TMV among Gladiolus and other isolates
2.5 多重RT-PCR检测唐菖蒲茎尖脱毒苗

利用多重RT-PCR方法对10株经茎尖脱毒处理的唐菖蒲组培苗进行检测。结果表明: 2株组培苗未脱除CMV,3株组培苗未脱除TMV(图 6)。运用单重RT-PCR验证,结果一致。证明了本试验建立的多重RT-PCR方法适用于脱毒苗的检测。

图 6 多重RT-PCR检测唐菖蒲组培苗 Figure 6 Detection of two viruses of Gladiolus in vitro plantlets by multiplex RT-PCR
3 结论与讨论

多重RT反应中引物可采用3种形式: Oligo (dT)、随机引物和特异引物。Oligo (dT)引物与RNA3'端Poly_(A)加尾结合,可用其检测带Poly _ (A)的病毒(Nie et al., 2000; 肖远辉等,2007)。随机引物会合成大量植物cDNA,干扰病毒cDNA合成效率。特异引物则有针对的合成病毒cDNA,提高了cDNA模板的纯度,减少了非特异模板的干扰(Katoch et al., 2002)。本研究的预试验中使用Oligo(dT)引物均未扩增出病毒条带,可能是因为CMV和TMV 2种病毒均不具有Poly_(A)尾,不适合用Oligo(dT)进行反转录。而采用2种病毒特异引物反转录得到的cDNA质量高,有利于后续PCR扩增。

在多重RT-PCR检测时因受到模板、酶等反应物的干扰,检测结果常出现假阴性。已有报道运用NADH脱氢酶nad5基因和mRNA作为内参照防止假阴性,提高检测结果的可靠性(牛建新等,2006; Menzel et al., 2002; Thompson et al., 2003)。在唐菖蒲中运用内参照检测病毒还未见报道。18S rRNA在植物体中含量很高,半衰期比mRNA长,周年存在于植物体内。本研究选用唐菖蒲18S rRNA作内参照,稳定地扩增出内参片段,这一内参同样适用于唐菖蒲其他病毒的检测。

多重PCR在同一反应中进行多个位点的特异扩增,引物间的配对、引物间的竞争性扩增等均影响扩增效果(黄银花等,2003)。本试验在选择多重扩增引物时避免了引物间、引物和其他模板间的互补配对,未产生非特异性扩增的干扰。筛选得到的引物Tm值较接近,保证了在相同的反应程序中均得到扩增。试验得到的扩增片段大小有一定差异,有利于电泳时区分产物。

据报道,国内外利用单重RT-PCR技术已成功检测了唐菖蒲上的多种病毒(Raj et al., 1998, 2002; 丁元明等,2008)。本研究建立了多重RTPCR检测体系并对扩增程序进行了优化,同时检测了两种病毒,简化了操作程序,比单重RT-PCR更经济、更高效。田间栽培的唐菖蒲往往受多种病毒的复合侵染,因此多重PCR方法有更广阔的应用前景。

参考文献(References)
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