侧柏(Platycladus orientalis)原产中国，分布远及日本和欧美，国内大部分省市均有栽培(石文玉等，1986)。侧柏耐干旱瘠薄、适应性强，是我国重要的造林绿化树种(曲绪奎，1987)。侧柏在长期生长发育过程中，受生态环境和异花授粉的影响，种内发生很大变异(李继华，1985)，形成不同的形态、生理和生态类型(苏霞等，2006)。近年来，许多学者针对侧柏种源地理变异规律(吴夏明，1986; 陈晓阳等，1990; 施行博等，1992; 杨传强等，2005)、生理生态特性(吴夏明等，1988; 李良厚，1989; 王华芳，1996; 戴建良等，1999)、核型分析(李林初等，1984; 马颖敏等，2009)等进行了大量的研究，但未见侧柏种源遗传多样性的研究报道，仅见有关柏科(Cupressaceae)植物遗传多样性的研究。张国盛等(2005)、红雨等(2006)对不同生境叉子圆柏(Sabina vulgaris)种群的RAPD分析表明:大部分的遗传变异存在于群体之内，种群的遗传分化与生境有着一定的相关性。张仁波等(2007)采用RAPD分子标记研究了崖柏(Thuja sutchuenensis)的遗传多样性，表明崖柏种源内和种源间均存在着广泛的表型及基因型的变异，空间距离和生态因子对崖柏种源进化的影响较小。张茜等(2005)通过对祁连圆柏(Sabina przewalskii)叶绿体DNA trnT-trnF序列研究，认为瓶颈效应和奠基者效应造成了祁连圆柏居群的遗传多样性分布式样。

作为显性分子标记，AFLP具有多态位点丰富、稳定重复性好、DNA用量少，可以在预先不知道基因组背景情况下进行研究等特点(白瑞霞，2008)。本文利用AFLP技术，对侧柏不同地理种源的遗传多样性进行研究，以探讨影响种源遗传多样性和遗传结构的因素，为侧柏种源选择、遗传改良、种源区划和遗传多样性保护提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试的18个侧柏种源来自于山东平阴大寨山和淄博原山林场的全国侧柏种源试验林。两试验林于1984年造林，大寨山试验林采取4株小区、9次重复的随机区组设计，淄博原山试验林为12株小区、4次重复设计，造林密度为2 m × 3 m。各种源分布于23°30'—43°57' N，81°20'—120°15' E之间。4月份采集当年生新叶放入自封袋中，每个种源随机选8~10个单株采样(表 1)。

1.2 研究方法 1.2.1 DNA提取

采用改良的CTAB法从硅胶干燥的幼叶中提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增

利用北京鼎国生物技术公司的试剂盒及其操作指南进行。用筛选出的8对引物(表 2)进行选择性扩增。PCR扩增总体积为25 μL，含预扩增稀释样品2 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，EcoR Ⅰ引物1 μL，Mse Ⅰ引物1 μL，Taq酶0.5 μL，H₂O 17.5 μL。PCR反应在Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer，USA)中进行。扩增程序为: 94 ℃预变性30 s; 65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，12个循环，每轮循环温度递减0.7 ℃; 接着94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，23个循环。

1.2.3 电泳与数据处理

扩增后的样品在ABI PRISM 377测序仪上进行电泳分离检测，得到AFLP的指纹图谱，生成由“1”和“0”组成的原始矩阵。计算多态性位点百分率(p) : p = (k/n) × 100%，式中: k为多态位点数目，n为所测位点总数。采用POPGENE 32计算等位基因平均数N_a、有效等位基因数N_e、Nei基因多样性指数H、Shannon信息指数I，总遗传多样性H_t、群体内遗传多样性H_s、遗传分化系数G_st和基因流N_m。采用Nei (1972)遗传距离，按非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。应用IBD 1.52(Bohonak，2002)进行Mantel检验，应用AMOVA1.55 (Excoffier et al., 1992; Huff et al., 1993)进行分子方差分析。

2 结果与分析 2.1 AFLP引物筛选与扩增结果

采用筛选“3 + 3”核心引物组合策略，从64对引物组合中，筛选出8对银染引物用于本试验，分别对供试材料的基因组DNA进行扩增，在侧柏18个种源176个样品中共获得1 613条多态性条带，平均每对引物扩增的总带数为202条，多态带百分率为92.91% (表 2)。其中E-AGG/M-CAG是最有效率的1对引物，其产生位点的多态性条带比率达到98.62%;而引物E-ACG/M-CAG扩增出的条带的多态性比率最低，其多态性条带比率为89.40%。

2.2 种源的遗传多样性

由表 3看出: 18个侧柏种源的多态位点百分率26.24%~55.94%，平均为46.04%。平均有效等位基因数为1.199 3，平均Nei's基因多样性指数0.123 9，平均Shannon信息指数0.194 9，而其种级水平分别达到1.26，0.168 4和0.277 7，结果说明侧柏的遗传多样性丰富。各种源的遗传多样性存在较大差别，云南文山Nei's基因多样性指数值最大，为0.153 1，山东平度的遗传多样性较低，仅为0.063 5; Shannon信息指数最大值为宁夏银川的0.237 1，最小值是山东平度的0.102 5。这些数据表明侧柏种源的遗传多样性比较丰富，其中南部的云南文山、福建南平，北部的新疆伊犁、内蒙古乌拉山等种源的遗传多样性程度高，山东种源的多样性程度较低。

2.3 遗传分化程度

遗传多样性分析结果显示: 18个种源总的遗传多样性H_t，群体内遗传多样性H_s和群体间遗传多样性D_st分别为0.168 4，0.123 9和0.045 5 (表 4)。G_st是衡量种群遗传变异最常用的指标，表示在总的遗传变异中群体间变异所占的比例，侧柏种源间的遗传分化系数G_st为0.262 2，说明种源间的遗传变异占总变异的26.22%，种源内变异占73.78%。AMOVA分析结果(表 5)表明:种源间的遗传变异占总变异的14.02%，而种源内变异占74.86%，区域间变异占11.12%，且其变异均达极显著水平(P＜0.001)，表明侧柏种源出现了较高程度的遗传分化，遗传多样性主要存在于种源内。

2.4 种源间的遗传一致度和遗传距离分析

遗传一致度和遗传距离分别是从相同和相反方面度量居群间遗传关系的指标，遗传距离反映居群亲缘关系的远近。从表 6中可以看出:遗传一致度最大的来自江苏铜山和陕西黄陵之间(0.988 8)，其遗传距离最小(0.011 3);而四川西昌和山东泰安间的遗传一致度最小(0.829 9)，遗传距离最大(0.186 5)。18个侧柏种源间的遗传一致度介于0.829 9~0.988 8之间，平均为0.938 9;遗传距离为0.011 3~0.186 5，平均值0.063 9，说明种源间保持了较高的基因相似度，遗传距离小。

2.5 聚类分析

基于侧柏样本间的遗传距离Nei (1972)进行UPGMA聚类(图 1)，将所有种源分为4大类，大致按地域聚在一起:第1类为南部种源，包括云南文山、福建南平、贵州贵阳、四川西昌、湖北荆门和河南确山6个种源; 第2类为北部种源，包括北京密云、内蒙古乌拉山、辽宁朝阳和新疆伊犁4个种源; 第3类为中部的6个种源，为甘肃徽县、江苏铜山、陕西黄陵、山西石楼、宁夏银川及河北易县; 第4类为山东种源，包括泰安和平度2个种源。聚类图显示纬度(地理距离)相近的种源被聚到了一起，反映了侧柏的遗传分化与生境有着一定的相关性，经Mantel检验，种源的地理距离与遗传距离之间显示正相关，但未达到显著性水平(r = 0.288 6，P = 0.093 0)。

3 结论与讨论 3.1 侧柏种源遗传多样性

本次研究所选的18个侧柏种源，是根据侧柏的生境(经纬度)不同选取的，8个引物检测到1 613条多态带，多态带比率达到92.91%，表明侧柏遗传多样性高。不过多态带百分率对遗传多样性只是一个粗略的估计，它不能够确定各条带在频率上的均匀程度(红雨等，2006)，且受到样本大小、条带多少、筛选的引物及筛选方法的影响。

侧柏在物种水平的多态位点百分率P为46.04%，Nei基因多样性指数H_e为0.168 4，Shannon信息指数I为0.277 7 (表 3)，与岷江柏木(Cupressus chengiana) (P = 77.17%，H_e = 0.225 7，I = 0.347 2) (姚莉，2005)、叉子圆柏(P = 77.17%，90.70%，H_e = 0.301 8，I = 0.453 4) (张国盛等，2005)和崖柏(P = 72.09%，H_e = 0.301 5，I = 0.436 0) (张仁波等，2007)等柏科树种相比，侧柏的遗传多样性较低。

侧柏南部种源(纬度＜31°14')和北部种源(纬度＞36°59')的遗传多样性高于中部种源和山东种源。因南、北种源一般分布于地形复杂的山区，交通闭塞，天然地理隔离明显，缺乏与外界基因的交流，且侧柏生境的人为破坏少，得以保存较高的遗传多样性。此结论说明:在南部和北部种源内进行优良种源选择时，选种数量宜多，适当缩小距离; 而中部种源应加大选种距离。

3.2 侧柏种源遗传结构和分化

Nybom(2004)总结了27份AFLP标记的植物遗传多样性研究结果，得出的G_st平均值为0.21; Hamrick等(1990)认为以异交为主的物种，90%的遗传变异发生在种源内部。侧柏种源间的基因分化系数(G_st)为0.262 2，与以上结果相比，侧柏种源呈现出种源间遗传分化大的特点。由G_st估算的侧柏种源基因流值为1.437 2，说明侧柏种源之间存在一定程度的基因交流，但Hamrick (1987)报道的4种针叶树的N_m值一般在5.3~37.8之间，异交植物N_m平均值为3.5(陈小勇，1996)，相比之下侧柏种源间的基因流明显处于较低水平，低水平的基因流可能造成侧柏种源对局部生态环境的适应，进而促使种源间的遗传分化。以往研究(Hamrick et al., 1990; Bartish et al., 1999)表明种子扩散机制会影响种群间的分化水平，靠风力散布的植物具有低水平的种群分化(G_st = 0.143 0)，而靠重力散布的植物具有较高的种群分化水平(G_st = 0.277 0)。侧柏主要依靠重力进行散播，其遗传分化系数为0.262 2，与以上结论一致，种子散播方式在一定程度上限制了基因的流动，从而增加了侧柏种源间的遗传分化。由于侧柏为雌雄同株异花风媒传粉植物，同一地区中相互授粉的机会多，基因交换频繁，种源的遗传基础趋于相似，因而位置相近种源具有较高的遗传一致性和较近的亲缘关系，可见地理隔离及传粉方式对侧柏种源遗传分化具有显著影响。另外，分布区内多样性的生态条件也是侧柏产生遗传分化的因素之一(邓朝经等，1986)，不同的基因型在不同生境上的适合度相异，导致具相同基因型的个体聚集在较适应的微生境中，从而产生遗传分化。因此，侧柏现有分布的间断性、地理隔离、环境因子造成的选择差、低水平基因流可能是导致其种源间分化的主要因素。

侧柏AMOVA分子变异分析显示:总遗传变异的14.02%来自种源间，74.86%来自种源内，11.12%来自区域间，因侧柏群体数目大并且为雌雄同株、风媒异花授粉植物，所以遗传变异的大部分驻留在种源内。此遗传结构说明在不同种源间进行选种具有很大的潜力，因此利用不同种源优异的性状与丰富的遗传多样性进行侧柏遗传改良具有广阔的前景; 开展侧柏良种选育时，在注重种源选择的同时，要加大种源内个体的选择力度，以选育出遗传多样性高的种源。

3.3 侧柏种源间的亲缘关系

本研究基于Nei(1972)遗传距离，利用UPGMA法进行聚类，将18个种源聚为4大类，湖北荆门以南种源聚为一类，山西石楼以北的聚为一类，两者之间的(中部)种源聚为一类，山东种源单独聚为一类，说明侧柏种源间的亲缘关系与地理位置相关，Mantel检验结果证实侧柏种源间遗传距离和地理距离间具有正相关性。不同种源聚类结果与梁一池(1990)、孙仲序等(1992)用生长性状进行侧柏种源区划分的结果基本一致。聚类结果为侧柏种源区划提供了分子基础，同时说明在调拨种子时，应从临近地区购进。为更好地进行侧柏良种选育、种源区划以及种子调拨区划分，建议在分子标记基础上，结合形态标记以及核型分析对侧柏遗传多样性进行综合评价，同时进一步利用分子标记结果进行侧柏遗传结构分析。