世界上天然杨树约100多种，我国有50多种。杨树作为重要造林树种，多用于水土保持、防风防沙和园林绿化，也是造纸、建筑及木材工业的重要经济树种。杨树易繁殖，生长速度快，生产周期短，在我国广泛栽培，我国也是世界上杨树人工林面积最大的国家(Carle et al., 2005)。

我国杨树引种和育种的历史可追溯到新中国建立时期，杨树种质资源十分丰富，我国已培育了许多优良杨树品种(马常耕，1995)。随着育种技术的发展，新品种产生的速度与日俱增。然而，由于杨树品种繁多，形态相似，容易出现品种混淆。特别是近年来杨树种苗市场的迅速发展，为了追逐经济效益，杨树种苗市场上出现了以次充好，甚至出现造假的现象(马常耕，2004)。急需切实加强植物新品种保护制度的实施力度，而建立一种稳定、快捷、高效和可靠的树木品种鉴别方法则成为树木品种权保护的关键技术，进而从根本上保证我国杨树商品性种植业的顺利发展。

按照国际植物新品种保护联盟的规定，目前植物新品种特异性、一致性和稳定性的测试采用生物学特性鉴定方法，但是，生物学特性易受外界环境干扰和生长发育时间的限制，而且周期较长。除利用生物学性状外，生化标记(同工酶和蛋白质电泳技术)也得到广泛应用(Rajora，1989; 赵晓平等，2008)。然而，同工酶和蛋白质电泳技术受取样的时间和样品的质量影响很大。许多学者都认为DNA分子标记技术可以作为树木品种鉴定的重要补充手段(Zheng et al., 2007; 王琼等，2008)。

分子标记方法有RFLP，RAPD，ISSR，AFLP，SNP和SSR，它们可单独运用(Matthias et al., 2009; Gao et al., 2006a; Sanchez et al., 1988; Castiglione et al., 1993; 李金花等，2009; 高建明等，2006)，也可结合使用进行杨树品种鉴定以及杨树品种间遗传关系和变异的研究(Fossati et al., 2005; Gao et al., 2006b; Rajora et al., 2003; Saša et al., 2009)。其中，SSR标记在杨树种内、种间以及品种间的鉴定分析研究中应用最广泛(Bekkaoui et al., 2003; Muhammad et al., 2002; 王辉等，2008; 梁海永等，2005; 张亚东等，2009)，并且国家林业局植物新品种保护办公室在实质审查中已有应用SSR标记鉴别有异议的杨树申请品种的案例(王琼等，2008)。

随着毛果杨(Populus trichocarpa)全基因组的测序工作完成，研究者可以在国际杨树基因组委员会的官方网站上获得大量关于杨树的SSR序列和SSR引物的信息(张勇等，2006)，基本不再需要研究者自己设计SSR引物，解决了SSR分子标记的关键技术。最新的SSR检测技术是TP-M13(Tailed primer-M13)(Markus，2000)毛细管自动电泳荧光检测法，TP-M13荧光标记技术采用3条引物来进行PCR扩增，通过M13链的退火，实现SSR引物的荧光标记。此法只需标记1条M13引物，而且还可通过不同颜色的荧光染料对M13引物进行标记，通过1次毛细管电泳就能同时检测多个SSR位点，较以前每个SSR正向或反向引物标记荧光的方法，具有低成本和高通量的优点(Huang et al., 2009)。毛细管电泳荧光检测法比聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术的自动化和程序化更高，而且系统软件还能校正各毛细管间的电泳差异，减少了试验的人为和系统误差，增强了试验结果的稳定性和可重复性，符合品种测定实验标准化的要求(易红梅等，2006)。TP-M13毛细管电泳结合多色荧光检测进行片段分析技术适应了新品种DNA指纹数据库构建的需求(郝晨阳等，2005)。

本研究采用TP-M13毛细管自动电泳荧光检测法对参试杨树品种进行SSR分析，旨在探讨TP-M13毛细管自动电泳SSR荧光检测法在杨树品种鉴别和亲子鉴定上的可靠性和可操作性，为分子标记在植物新品种DUS(Distinctness-Uniformity-Stability)测试指南的研制和杨树品种DNA指纹数据库的构建奠定技术上的基础，为新品种申请、品种权纠纷处理、保护育种者权利等，提供客观、科学和准确的技术保障。

1 材料与方法 1.1 试验材料

共14个杨树品种(表 1)。

1.2 试验方法

1) DNA提取 每个供试材料均选取1个单株，取枝条上无病害嫩叶(200 mg)。使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总DNA。提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中电泳后，经凝胶成像系统检测所提DNA的含量和质量。

2) PCR扩增 从国际杨树基因组联盟(http://www.ornl.gov)公布的杨树SSR引物中选取已作图标记的58对SSR引物，从中选取能够在样品中扩增出清晰片段的引物(表 2)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用3条引物来进行PCR扩增。第1条引物是SSR正向引物的5'端和M13(-21) 的序列相连组成带M13尾巴序列(5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3')的引物(例如: GCPM_1037的正向引物序列为5'-ATG AAA TTC GCA AAG TCA GT-3'，那么GCPM_1037的正向引物为5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATG AAA TTC GCA AAG TCA GT-3')，第2条引物为正常的SSR反向引物，第3条引物是5'端标有CY5荧光标记的M13尾巴引物。PCR反应程序和反应体系参照文献(Markus，2000)。所用样品DNA浓度不低于20 ng· μL^-1，反应体系中使用一管便携式PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)。

3) 毛细管电泳 将甲酰胺与分子量内标按100: 1的体积比混匀后，取15 μL加入上样板中，再加入1 μL稀释10倍的PCR产物。然后使用BECKMAN CEQ8000遗传分析仪进行毛细管电泳。使用GenomeLab System遗传分析系统中的Fragments片段分析软件对数据库收集的原始数据进行分析，系统将各峰值的位置与其泳道中的分子量内标的位置做分析，得到片段大小。一个位点的片段大小代表样品在这个位点的基因型。

1.3 品种鉴别方法

为了避免试验误差，保证试验结果的可靠性和可重复性，每个样品进行2次PCR和毛细管电泳荧光检测重复。对于不知父母本的品种，选取同种的所有品种都扩增出片段的SSR位点; 对于已知父母本的杂交品种，根据孟德尔遗传规律选取SSR位点，根据品种间的SSR位点的基因型不同来分析判别品种。

2 结果与分析 2.1 美洲黑杨品种的鉴别

8对SSR引物在4个美洲黑杨品种中均能扩增出清晰条带(表 3)。4个美洲黑杨品种在2，28和49号SSR位点的基因型一样，在4，18，45，54和92号SSR位点的基因型出现多态性，其中92号SSR位点的基因型都不一样。美洲黑杨‘174’与美洲黑杨(mzhy)在5个SSR位点的基因型不同。美洲黑杨‘2KEN8 ’、美洲黑杨‘55/65’和美洲黑杨(mzhy)三者之间在4个SSR位点的基因型不同。美洲黑杨‘174 ’与美洲黑杨‘2KEN8’和美洲黑杨‘55/65’在3个SSR位点的基因型不同。如果基于3个不同位点来区分这4个品种的话，那么只需4，18，54和92号引物。

2.2 欧洲黑杨品种的鉴别

9对SSR引物在5个美洲黑杨品种中均能扩增出清晰条带(表 4)。5个欧洲黑杨品种在2，28和30号SSR位点的基因型一样，在4，18，48，53，82和85号SSR位点的基因型出现多态性，其中4号SSR位点的基因型都不一样。欧洲黑杨‘N12’，‘N153’和‘N172’与欧洲黑杨CK2和CK3在6个SSR位点的基因型不同。欧洲黑杨‘N153’与欧洲黑杨‘N172’在3个SSR位点的基因型不同。欧洲黑杨‘N12’与欧洲黑杨‘N153’和‘N172’在4个SSR位点的基因型不同。欧洲黑杨CK2与欧洲黑杨CK3在5个SSR位点的基因型不同。3个转基因欧洲黑杨品种与2个非转基因欧洲黑杨品种差异明显(图 1)。如果基于4个不同位点来区分这5个品种，那么只需4，18，82，53或85号引物。

2.3 杂交品种的鉴别

58对SSR引物中有11对SSR引物在‘森海1号’和‘森海2号’2个品种及其父母本中均能扩增出清晰条带，有8对SSR引物在‘丹红杨’和‘巨霸杨’2个品种及父母本中均能扩增出清晰条带，15，39，60和80号SSR位点是青杨特有的位点，5号SSR位点是美洲黑杨‘55/65’特有的位点(表 5)。

‘森海1号’和‘森海2号’在80和54号(图 2) SSR位点的基因型不同。‘丹红杨’和‘巨霸杨’在4个SSR位点的基因型不同。‘森海1号’和‘丹红杨’在5个SSR位点的基因型不同。‘森海2号’和‘丹红杨’在3个SSR位点的基因型不同。‘森海1号’和‘巨霸杨’在3个SSR位点的基因型不同。‘森海2号’和‘巨霸杨’在2个SSR位点的基因型不同。只需18，45，54和61号引物就可以区分这4个同一母本不同父本的品种，区分3个亲本需要7和18号引物。‘丹红杨’的父母本在2和45号SSR位点上均没有109 bp和129 bp这2个基因型(图 3，图 4)。

3 结论与讨论

本研究的试验材料包括杨树的黑杨派(Sect. Aigeiros)(美洲黑杨和欧洲黑杨)和青杨派(Sect. Tacamahaca)(青杨)，结果(表 3，4和5) 表明杨树不同派间的SSR位点基因型差异明显，每个派的样本均有特异带，表明SSR标记可用于不同派间品种的鉴别，进一步说明SSR标记可用于杨树分派的分子系统学与派间杂交的研究。

目前，转基因产品的检测方法主要是基于插入的外源基因和表达产物的基础上，包括DNA检测方法和蛋白质检测方法(贺熙勇等，2008)。本研究通过对转基因和非转基因的欧洲黑杨5个品种的SSR分析，转基因与非转基因的欧洲黑杨品种在一些SSR位点的基因型差异明显，说明SSR标记也可用于鉴别通过基因工程手段获得的品种。

杂交品种的谱系关系分析结果发现:‘丹红杨’在2和45号2个SSR位点上的基因型不符合孟德尔遗传规律，造成这个结果的可能原因有3种:一是参试的美洲黑杨‘2KEN8’植株不是杂交试验时所用的真正父本; 二是在人工控制授粉时，花粉可能不纯或被污染，造成美洲黑杨‘2KEN8’不是‘丹红杨’的父本; 三是参试的‘丹红杨’植株发生了突变。由于本试验没有对其他‘丹红杨’植株进行SSR分析，所以这个原因还不清楚，还需要继续研究。但说明SSR标记用于杨树品种亲子鉴定的潜力。

杂种谱系关系的分析表明:有父母本作为背景，可更准确地知道子代间的差异和基因组变化的情况。建议在植物新品种的申请文件中，包含育种者提供的候选品种及其亲本品种的DNA指纹图谱数据和图片，用于建立新品种数据库，以便在新品种审定时查询及在品种权有争议时进行鉴定(李汝玉等，2000)，从而保护育种者和种植者的利益。

无论是通过人工控制授粉杂交的常规育种手段，还是通过现代转基因工程手段获得的杨树品种，SSR分子标记都能准确地将它们区别，进一步证明了SSR标记在DNA水平上能科学、准确地判断特定品种的特异性，为进一步探讨SSR标记在品种DUS测试中的的直接应用提供了基础。目前，品种鉴定还是以生物学特性鉴定为主，但对于无性繁殖的无性系品种和表型差异不明显的品种，更适合应用分子标记技术来进一步鉴别。所以为了提高鉴别品种的精度，可以用分子标记技术与表型分析相结合的方法。

由于SSR等分子标记分析方法的重复性和再现性不稳定，不同实验室之间差异较大，为此，有必要制定利用分子标记分析技术的统一规范和标准，保持试验方法的一致性和稳定性，提高不同实验室、不同操作人员之间试验结果的重复性和再现性。目前国家林业局植物新品种保护办公室已建立了2个植物新品种分子测试实验室，为进一步开展分子标记技术在植物新品种测试和管理上的应用奠定了良好基础。今后的重点是为不同树木种类筛选合适的生化标记(同工酶)和分子标记(DNA)，研制植物品种分子标记测试指南，构建林木品种分子标记描述数据库等，更好地为新品种测试与鉴定提供补充依据，直至直接用于DUS测试(Zheng et al., 2007)。

致谢:

中国林业科学研究院韩一凡研究员和胡建军副研究员为本试验提供了宝贵材料