造纸黑液中含有大量难以去除的有机物质及无机物质，其中木质素占废液总量的1%~2%，占总固形物的30%。如果制浆造纸过程中大量木质素得不到利用，会造成严重的环境污染，成为制约造纸业发展的一个重要因素。利用木质素降解菌对造纸原料进行生物处理，可以降低制浆成本、改善成浆质量，从根本上解决造纸行业对环境的严重污染状况，对我国的可持续发展战略产生积极的影响(Berrocal et al., 2000; Camarero et al., 1998; Idarraga et al., 2001)。

目前对于木质素生物降解的研究主要集中在降解木材的性能和木质素酶类特性等方面，其中，研究最多的是木质素降解酶类的特性方面(范美霞等，2010; 张希根等，2009; 黄乾明等，2007)。虽然对毛栓菌(Trametes trogii)降解木质素结构的研究也有相关报道(池玉杰，2005)，但有关其降解木质素过程中木质部细胞微观结构的变化和降解产物的研究国内外报道很少。

Trametes trogii WT-1是本实验室从自然界中分离得到的一株毛栓菌。初步研究表明:该菌株具有很强的木质素降解能力，能使细胞复合胞间层降解，解离纤维束，是一株高效木质素降解菌株。本文应用扫描电镜观察并结合红外图谱分析对Trametes trogii WT-1降解杨木木质素的过程进行了初步研究，以期为木质素生物降解机制的研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

菌种Trametes trogii WT-1为本实验室分离保存。杨木材为25年生的欧美杨107杨(Populus × euramericana ‘Neva’)。根据国家标准-《木材天然耐腐性实验室试验方法》(GB/T 13942.1-2009)，将野外采回的欧美杨107杨，晾干后锯成2 cm × 2 cm × 1 cm的木块。105 ℃烘至恒重，高压灭菌后使用。

1.2 方法 1.2.1 WT-1降解杨木块试验

按照国家标准(GB/T 13942.1-2009)，将WT-1接种河砂锯屑培养基内，7天后将杨木块样品放入长满WT-1菌丝的河砂锯屑培养基内，置于28 ℃、相对湿度60%的恒温恒湿培养箱内，分别于40，80，120天后取出木块，除净表面菌丝，105 ℃烘至恒重，装入干燥器中待用。

1.2.2 木质素含量的测定

根据受菌降解前后杨木块的质量变化，计算分解后杨木块质量减少百分率，按照造纸原料酸不溶木素含量的测定(GB/T 2677.8-94)，分析降解前后木质素含量的变化。

1.2.3 杨木块的扫描电镜观察

杨木块的扫描电镜观察参照文献(陈敏忠等，1996; 李永敬等，1988)进行，用刀片切下体积约为3 mm³的样品木块，脱水后放在喷镀仪中进行导电处理，在JSM-6610LV型(日本JEOL公司)扫描电子显微镜下观察木材的纤维构造。

1.2.4 杨木块的红外光谱分析

刮取烘干样品表层木粉，采用KBr压片法，在FT-IR Nicolet 380光谱仪(美国Thermo Electron公司)上进行红外光谱的测定(江泽慧等，2007; 杨忠等，2007)，测量范围为400~4 000 cm^-1。

2 结果与分析 2.1 WT-1对木质素的降解过程

WT-1对木质素的降解初期较为缓慢。降解40天后，样品中木质素的含量与对照相比，未有显著性差异(P＜0. 05); 80天后，杨木块的降解加速，其质量分别损失了32. 2%和53. 7%，木质素含量与对照相比分别减少了45. 2%和52. 1%;至120天时，降解速度又趋于减缓，木块质量与80天时相比仅减少21. 5%，木质素含量减少6. 9% (图 1)，因此，WT-1对欧美杨107杨木块木质素的降解过程呈现出慢－快-慢的规律。其原因可能是:初期由于植物细胞组织的阻碍，WT-1菌丝的侵入过程缓慢，木质素的降解仅发生在表层，降解缓慢; 随着降解过程的继续，表层木材组织受到破坏，菌丝体逐渐侵入木材内部，WT-1侵染范围和空间增加，同时，WT-1也可以以木材初期降解的产物为营养，菌生长加速，降解速度加快; 至后期，WT-1菌丝已基本遍布所有可能的侵入空间，同时木材组织可降解成分减少，菌生长所需的营养供应受到限制，菌丝生长受到抑制，因此，降解速度变慢。但此时木块的组织结构已受到完全破坏，木材的颜色已由白色变为暗黄色，表面皱缩，失去原有的性状。

2.2 木质素降解过程的扫描电镜观察

图 2为欧美杨107杨木块在WT-1降解过程中木材组织的显微结构的扫描电镜图片，其中图 2a~d为未受WT-1侵蚀的对照样品的纵切面(图 2a，b)和横切面(图 2c，d)扫描电镜图片。由图片可以看出:未受侵蚀样品的纤维组织完整，木纤维细胞内壁有黏稠物质附着，壁上的纹孔结构清晰完整，木纤维细胞胞间层较厚。受WT-1侵蚀40天后，各组织细胞结构基本完整(图 2e)。在导管细胞内开始有微量的菌丝出现，木射线和木纤维细胞中也有少量菌丝生长(图 2f)。初生的菌丝通过导管槽进入导管内腔，在导管腔内呈对角线式附着(图 2g)。横切面结构完整，胞间层减薄不明显(图 2h)。受WT-1侵蚀80天后，在导管细胞中可见大量菌丝生长，木射线上的纹孔由于侵蚀显著变大，胞壁出现腐蚀孔，局部发生破裂(图 2i)。菌丝通过胞壁上形成的腐蚀孔进入相邻细胞，由胞腔向胞壁发展，最后蔓延至整个木纤维组织(图 2j)。由于木纤维胞间层受到侵蚀，木纤维细胞壁上出现孔洞及沟槽，继而发生解离，部分细胞的细胞壁变薄破裂(图 2k)，此时导管中的粘状物质已经被降解，尽管整体结构还保持完整，但管壁明显变薄(由2.88 μm减薄到1.44μm)，局部胞壁上形成了腐蚀沟槽和孔洞(图 2l)。受WT-1侵蚀120天后，木材组织的各类细胞之中已遍布WT-1菌丝(图 2m)，纤维细胞的胞壁明显变薄，有的已发生破碎开裂，木射线结构受到破坏，仅剩少量残余碎片(图 2n)，木材组织已变得非常松散，大量木纤维解离，形成沟槽或被完全降解(图 2o)，导管细胞的胞壁也发生了破裂(图 2p)，木材的组织结构已受到完全破坏。

从侵蚀木材组织的途径上看，李永敬等(1988)在利用彩绒革盖菌侵蚀美洲黑杨Ⅰ-69 (Populus deltoides ‘Lux’)样本的过程中，菌丝同样是将导管作为突破口，然后通过纹孔和胞壁上的腐蚀孔蔓延，这与本试验的结果一致。通过扫描电镜观察WT-1侵蚀欧美杨107杨木块胞壁，可以判别木质素的降解和损害所达到的层次。从试验中可以观察到欧美杨107杨木纤维次生壁S3层和导管壁对WT-1具有很强的抵抗能力，它们仅在侵蚀80天以后才出现明显变化，这与陈敏忠等(1995; 1996)的结果一致。与前人研究不同的是: Ⅰ-107杨木块受侵蚀后期，WT-1对导管壁的侵蚀不是仅仅停留在木纤维次生壁S₃层上，而是木纤维胞壁减薄并且严重破损，出现了细胞的收缩和崩溃，试样的外观发生明显变化。

2.3 木质素降解过程的红外光谱分析

图 3为杨木受WT-1降解不同时期的红外光谱图。羟基分为酚羟基和醇羟基，木材中酚羟基的含量与木质素的缩合程度密切相关。图中3 419 cm^-1处强的吸收峰即为羟基中的O—H伸缩振动，由图可以看出:随着降解时间的延长，此吸收峰强度明显减弱，表明木质素结构单元受到了破坏。在木质素的特征官能团中2 942 cm^-1处的吸收峰为甲基、亚甲基中C—H伸缩振动吸收峰，其吸收峰增强，表明木质素结构发生变化。

1 635~1 558 cm^-1的吸收峰反映了木质素芳香核结构的特点(Mari et al., 2003)。在受WT-1降解过程中，表征木质素侧链上的羰基(C＝O)伸缩振动的吸收峰(1 635 cm^-1)和表征苯环碳骨架(芳香核)结构伸缩振动的吸收峰(1 614 cm^-1)发生了明显变化，由双峰变成了单峰(1 633 cm^-1)，羰基(C—O)伸缩振动的吸收峰(1 635 cm^-1)变得不明显，说明木质素结构单元侧链上的羰基已受到破坏; 苯环骨架结构伸缩振动吸收峰(1 614 cm^-1)在受WT-1降解过程中逐渐减弱，表明在降解过程中苯环结构也受到破坏。受WT-1降解120天后，1 556 cm^-1苯环骨架结构伸缩振动的吸收峰明显减弱，说明苯环结构单元已受到严重破坏。木质素主要有愈疮木基丙烷和紫丁香基丙烷2种前体物质。受WT-1降解后愈疮木基丙烷的特征吸收峰1 520 cm^-1和紫丁香基丙烷的吸收峰1 516 cm^-1的谱峰均有所增强，说明木质素大分子已发生了降解，其中愈疮木基丙烷的特征吸收峰1 520 cm^-1变化更为明显，表明该结构单元可能更易为WT-1分泌物降解。

1 398~1 457 cm^-1 2处吸收峰为苯环与苯环之间通过C—C结合的官能团特征吸收峰，在受WT-1降解过程中该吸收峰逐渐减弱，至降解80天后，吸收峰强度明显减弱，说明木质素大部分已经降解，木质素芳香核之间通过碳-碳键(—C—C—)连接的空间网状结构已经被破坏。在木质素苯环间的侧链上存在CH₂，1 457 cm^-1的吸收峰即为其特征吸收峰。在受WT-1降解过程中该吸收峰也逐渐减弱，说明在木质素降解过程中木质素分子的侧链也发生了降解。

3 讨论

白腐菌在生物学上分类属于担子菌类(Dsidiornycetes)，腐生于树木或木材上，有很强的降解木质素大分子的能力，在制浆造纸废水的生物处理上有良好的应用。目前，有关白腐菌的研究报道较多，但主要集中在木质素降解酶类特性及其应用方面，有关白腐菌腐朽木材过程中木质部细胞超微观结构的变化和木质素降解产物的研究报道较少。Morohoshid等(1986)通过对白腐菌对木材腐朽过程的研究认为白腐菌对胞间层的降解主要有2种途径:一是通过穿透到胞间层中的菌丝降解; 另一种是细胞腔中的菌丝分泌的胞外酶扩散到胞间层所致。本文的研究结果显示: WT-1在腐朽杨木的过程中，菌丝多是通过扩大的纹孔向四周蔓延的，偶尔也能看到菌丝在纤维壁上穿孔(图 2i，j)，菌丝在穿过细胞壁时，可对胞间层产生一定范围的降解(图 2m，n); 同时，在腐朽过程的后期纤维胞间层发生局部解离，而最先发生解离的区域是在上下纤维相锲接的端部(图 2k)，这些区域在腐朽过程中表现比较脆弱，WT-1分泌的胞外降解酶可能首先在这个区域对胞间层产生降解，并由此纵深方向发展，最终使纤维解离出来(图 2o，p)。因此，WT-1对杨木的腐朽过程中以上2种途径都是存在的，但细胞腔中的菌丝分泌的胞外酶扩散导致胞间层的腐朽是主要途径，这与其他多种白腐菌腐朽木材的途径是一致的(陈敏忠等，1996)。

Liese等(1970)和Ruel等(1981)认为:白腐菌腐朽木材的方式主要有2种:一是通过菌丝与细胞壁直接接触而产生腐蚀，但这种腐朽的降解酶扩散范围一般很小，主要限制在菌丝附近; 二是通过胞外酶的扩散作用来完成对远离菌丝的细胞壁、胞间层以及细胞角隅等的降解。通过对WT-1腐朽杨木过程的电镜照片观察偶尔看到菌丝在细胞壁上穿孔以及菌丝附近扩大的纹孔(图 2i，j)，因此，WT-1可以通过菌丝与细胞壁直接接触而对细胞壁产生腐蚀。通过观察还可以发现在侵入木材细胞腔内的WT-1菌丝的周围包有一层黏液状覆盖物，(图 2m)，而这种黏液状物质可能与其胞外降解和代谢活动密切相关。Kim等(1993)证明在真菌菌丝周围覆盖的黏液中有胞外代谢物存在。Evans等(1991)也证明云芝菌等分泌的漆酶可以通过菌丝粘液层扩散到细胞腔，为黏液覆盖的细胞壁会发生降解(Highley et al., 1987)。在扫描电镜下可以观察到在WT-1菌丝未达到的地方，有些细胞的细胞壁产了生腐朽沟槽，并且可以看到其中有很多细胞壁的降解产物-微小颗粒的存在(图 2o，p)，说明这些地方的细胞已经发生了降解，而其降解作用很可能就是由于菌丝所分泌的粘液四处蔓延和渗透所致。因此，WT-1腐朽木材的方式也是有2种:一是通过菌丝与细胞壁直接接触而产生腐蚀; 二是通过胞外酶的扩散作用而产生的腐蚀。这也与报道的其他白腐菌腐朽木材的方式是一致的(Liese et al., 1970; Ruel et al., 1981; 陈敏忠等，1996)，但其具体的腐朽机制还有待于探索和研究

总之，本文结合扫描电镜观察和红外光谱方法，首次对毛栓菌(Trametes trogii WT-1)腐朽欧美杨107杨木材的过程进行了分析，并对该菌对胞间层的降解途径及腐朽木材的方式进行了探讨，为深入研究毛栓菌腐朽木材的机制以及其开发利用提供了参考。