文章信息
- 樊永军, 闫伟, 王黎元
- Fan Yongjun, Yan Wei, Wang Liyuan
- 贺兰山地区青海云杉外生菌根的形态类型及分子鉴定
- Morphological Type and Molecular Identification of Ectomycorrhizae on Picea crassifolia in Helan Mountain
- 林业科学, 2011, 47(6): 108-113.
- Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(6): 108-113.
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文章历史
- 收稿日期:2009-11-18
- 修回日期:2010-05-19
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作者相关文章
2. 内蒙古农业大学林学院 呼和浩特 010018
2. Forest College, Inner Mongolia Agricultural University Huhhot 010018
在国内,从一个树种的角度,系统地研究与之共生的菌根类型的工作开展得很少。赵忠等(1993)将杨树(Populus)的菌根分为14个不同类型,从中鉴定出5种菌根真菌。唐明等(1994a; 1994b)、陈辉等(1997)通过对杨树的7种外生菌根的形态特征研究,认为依据菌根的形状、颜色、菌索等特征鉴定外生菌根有一定的可行性,并总结国内外杨树菌根的研究成果,认为杨树菌根为内外生混合菌根,有30种外生菌根和5种内生菌根。对杉类树种的菌根研究国内仅见张艳辉等(1999)对武夷山自然保护区南方铁杉(Tsuga tchekiangensis)林外生菌根的分类研究,初步鉴定出外生菌根45种。此外,饶本强等(2000)运用同样手段鉴定菌根,对武夷山自然保护区马尾松(Pinus massoniana)外生菌根也进行了研究,并初步鉴定出外生菌根43种。对青海云杉(Picea crassifolia)外生菌根真菌多样性的记载仅局限于子实体的调查,尚衍重等(1998)、张弓等(2000)和宋刚等(2001)曾列出与云杉属共生的外生真菌名录,但该名录仅限于对该地区大型真菌的调查以及对资料中提及能形成外生菌根的真菌的总结,对这些真菌与云杉属共生的状态并未做更深入的研究,而且有一些外生菌根真菌子实体存在于地下或有一些并不产生子实体结构,同时对于青海云杉到目前为止没有系统、全面的调查研究。本文从形态学、解剖学的角度对与青海云杉共生的外生菌根真菌做了初步的类型划分,并利用分子生物学手段对其进行物种鉴定研究。
1 材料与方法 1.1 材料试验材料为取自贺兰山地区试验样地的青海云杉外生菌根。
1.2 方法 1.2.1 菌根的采集样品的采集按照Agerer (1991)方法进行,在青海云杉纯林群落中根据不同海拔随机选取3~5个样地,在所有的样地内用小铁锹沿着各自树种根部挖至根的末级,取20 cm × 20 cm × 20 cm带有细根的土块装入塑料袋中并编号,每一样地取3~5袋,每个生长季每个树种至少取2次样(2006,2007和2008),每次每个样至少采集3个样品,共采样81袋; 采回的样品置于4 ℃冰箱中保鲜待测,保藏时间不超过1周。
1.2.2 清洗、处理从冰箱中取出一袋样品,置于筛子中用自来水小心地清洗菌根表面的沙土,洗净后剪成长约1cm的根段,然后将小根段置于体视显微镜下用镊子、细小的毛刷及解剖针进一步清洗。
1.2.3 宏观形态观察在体视显微镜下,观察记录菌根的形状、颜色、分叉情况、菌索及外延菌丝的有无、菌套表面质地、是否透明、有无囊状体等等,利用电脑显微照像系统进行拍照并记录其形态特征; 同时选取新鲜、幼嫩、纯净的同一分支系统菌根2 ~ 3个,置于CTAB缓冲液的Eppendorf中,室温保存,作为DNA提取的样品。
1.2.4 显微结构观察新鲜菌根的菌套制片:将上述分类的新鲜菌根先在解剖镜下用解剖针和镊子把菌套剥下,取一干净载玻片,在中央滴一小滴水,将剥下的菌套碎片置于玻片水滴上,再在水滴上滴1 ~ 2滴甘油,用解剖针和镊子轻轻拨动使有些菌套外层朝上,有些菌套外层朝下,盖上盖玻片制成临时切片。在OLYMPUS-BH2显微镜下观察菌套内外表面菌丝的排列方式、外延菌丝的形状、直径,菌索的类型以及菌丝是否有隔有核、分叉、锁状联合等项目,最后记录并拍照。
永久封片制作:将新鲜菌根的短根组织(2~ 3 mm长的根段),固定于FAA中,采用常规石蜡切片法,番红固绿双重染色,中性树胶封片。
1.2.5 分类利用显微摄影系统在10 × 40倍下观察拍照并记录结果,利用外生菌根的宏观形态特征和显微结构特征,即采用菌根的颜色、分叉形状、菌套表面质地、外延菌丝、菌索、囊状体、锁状联合、菌套排列图式等为鉴定依据,参照Agerer等(1996),Agerer (1997—2006)体视显微镜菌根图谱和Haug等(1992)菌根图谱进行比较、分类鉴定。
1.3 分子鉴定 1.3.1 总DNA的提取供试外生菌根根尖材料为保存于CTAB中室温保存的11个不同的菌根类型样品。用于DNA提取的根尖取自同一菌根分支系统,采用Jakucs等(2005) CTAB法,总DNA的提取应用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒,操作步骤严格按照试剂盒步骤进行操作。
1.3.2 PCR扩增1) 反应体系所需试剂 一管便携式2 × Master Mixture,天根生化科技有限公司; DNA标准分子量标记:100bp DNA Ladder Marker,天根生化科技有限公司。
2) 供试引物 rDNA的扩增引物(由上海生工生物工程公司合成) : ITS1F和ITS4 (White et al., 1990; Gardes et al., 1993; 1996)
3) PCR产物纯化试剂 采用TIANgel Midi Purification Kit离心柱型PCR产物回收试剂盒。
1.3.3 PCR扩增产物的回收与纯化PCR扩增产物经电泳和凝胶成像系统检测后,运用天根生化科技有限公司的离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从含有扩增产物条带的琼脂糖凝胶上回收、纯化,具体操作依试剂盒的操作手册。
1.3.4 PCR扩增产物的克隆采用TaKaRa pMD18-T Vector (大连宝生物工程有限公司生产)为克隆载体,操作步骤严格按照实验说明进行操作。
1.3.5 DNA测序经PCR快速筛选出目的DNA片段后,吸取新鲜菌液于1. 5 mL离心管中送上海生工测序; 未制克隆的供试真菌材料,用纯化后的PCR扩增产物和引物直接测序。测序均由上海生工生物工程公司完成。
2 结果与分析 2.1 形态、解剖学特征 2.1.1 类型Ⅰ Inocybe sp. + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-1) 菌根系统呈规则或不规则的单轴金字塔形到单轴羽状分支,分支1~2级,簇生,菌根因子长度可达8~10 mm,直径0. 5~0. 8mm,不分支的末端直或弯曲,菌根肉色,有柄,较长,菌根因子明显地膨大呈棒状。外延菌丝稀疏,短,柔毛状。无根状菌索。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-12; 图版Ⅱ-1) 菌套外表面被有类膜状菌丝,菌丝表面光滑,壁厚,1. 5~2. 5 μm,且常粘合在一起,有隔,无锁状联合,呈拟薄壁组织,菌丝细胞形态各异,直径5~20 (25) μm,具不规则分支,菌套类型为N。菌丝内表面为密丝组织,排列紧密,多个菌丝束平行地粘合于菌套内表面。
横切面:平面观菌套为密丝组织,不分层,菌丝细胞扁平不规则,壁厚,排列紧密,菌套层30~40 μm,单宁层较厚,厚度25~30 μm,间断,由圆形或椭圆形细胞组成,哈蒂氏网深入皮层细胞2~3层,菌丝细胞为圆形,末端未达到内皮层。
2.1.2 类型Ⅱ Cortinarius atrocoerulaeus + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-2) 菌根传统二叉状分支,扭曲,菌根因子长3~15 mm,直径1~2 mm,褐红色,外被有纯白色粉末,且为疏水性的,外延菌丝为纯白色,有根状菌索,表面观菌套薄,不易剥离。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-13; 图版Ⅱ-2) 菌套外表面为密丝组织,菌丝交织不紧密,排列具固定模式,菌丝叉状分支,且分支间交织,表面观有一些菌丝或菌丝束交织形成环状或平行排列,但不明显,菌丝壁薄,透明,有隔,具锁状联合,且菌丝间有桥式接合方式,菌套内表面菌丝或菌丝束的环状和平行排列较菌套外表面要明显。菌套类型为A、B和C。
2.1.3 类型Ⅲ Helvella cf. acetabulum + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-3) 菌根系统单轴分支,有的多级分支而成珊瑚状,菌根因子无柄,长3~15 mm,直径2~3 mm,菌根红褐色,尖端圆钝,因菌根因子的阶段性生长,所以隔一定距离有一个缢缩,使菌根外观上呈节段状。菌根表面不光滑,似乎有短的乳汁管分布,且粘有土壤颗粒,外延菌丝绒毛状,较长,基部呈黄色,具根状菌索。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-14; 图版Ⅱ-3) 菌套为典型拟薄壁组织,菌套内外表面菌丝结合形成网状到表皮细胞状,菌丝细胞壁厚,褐色,二叉状分支,缠绕形成网眼,菌套类型为L和M。
横切面:平面观菌套为拟薄壁组织,菌套厚30~40(60) μm,不分层,菌丝细胞为圆形或椭圆形,单宁层2~3层,厚22~27 μm,由圆形细胞组成,哈蒂氏网深入到皮层细胞3~4层,末端达到内皮层细胞,菌丝细胞为椭圆形或圆柱状。
2.1.4 类型ⅣAmphinema byssoides + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-4) 菌根系统单轴分支,分支0~1级,菌根因子长1~10 mm,直径2~3 mm,红锈色,有光泽,菌根直或弯曲,末端圆钝,基部有节段状结构,外延菌丝黄色,绒毛状,相互缠绕,粘有土壤颗粒,有根状菌索,表面观菌套好厚易剥离。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-15; 图版Ⅱ-4) 菌丝呈拟薄壁组织,排列具一定模式,菌丝排列紧密,卷曲缠绕,叉状分支,交互缠绕形成环状花斑或平行状镶嵌于菌套表面,菌丝有隔,锁状联合不明显,菌丝细胞壁厚,细胞质均匀。菌套类型为P和Q。
横切面:平面观菌套薄,密丝组织,单宁层厚,厚度30~40 μm,3~4层,单宁层细胞为圆形,间断,菌丝细胞从其间断处深入到皮层细胞间,哈蒂氏网深入外皮层3~4层,达内皮层细胞,且菌丝细胞圆形排列紧密。
2.1.5 类型ⅤInocybe sp. + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-5) 菌根系统单轴金字塔形分支,分支2~3级,菌根因子长(2)4~20(30) mm,直径1~2 mm,菌根因子乳白色,呈棒状,有柄,极短,且不分支的末端尖削,表面观菌套厚,透明,易剥离,外延菌丝短,稀疏,不易观察到。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-16; 图版Ⅱ-5) 菌套外表面为密丝组织,菌丝排列无固定模式,菌套菌丝分支不明显,但菌丝壁凹凸不平,薄厚不均匀,菌丝纤细,扭曲,结合紧密地镶嵌于菌套的表面; 菌套内表面菌丝缠绕相对比较疏松,也无固定模式,菌丝纤细,透明,细胞壁薄。
横切面:菌丝套较厚,分层,外层细胞比较凌乱,细胞无规则,由长的条形细胞组成,细胞壁较薄,内层为拟薄壁组织,排列紧密,由圆形或椭圆形细胞组成,细胞壁比外层细胞相对较厚,单宁层较厚,间断,哈蒂氏网深达内皮层细胞,排列呈迷路状。
2.1.6 类型Ⅵ Cenococcum geophilum + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-6) 菌根自尖端幼嫩部至成熟部均为黑色,大多不分支,少数为二叉分支,最多只有2级分支,菌根尖端明显膨大,菌根因子长度为3~4 mm,直径为0. 4~0. 6 mm,表面有大量的外延菌丝且菌丝刚硬、深色,没有发现根状菌索,菌根周围有丰富的菌核,菌核球形,椭圆形,深黑色,直径0. 05~3 mm,表面也有刚硬的菌丝放射状伸出,菌核表面光滑,但无光泽。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-17;图版Ⅱ-6) 菌丝拟薄壁组织,排列紧密,呈星状,平行排列的菌丝在中央伸向一处,隆起,越往中央菌丝的壁越厚,而凹陷处的菌丝壁较薄,颜色较淡,菌套菌丝有隔,厚壁,直径(4. 9 ± 0. 9) μm,整个菌套表面由一个接一个排列整齐的星状突起连接而成,突起之间的距离为(68. 2 ± 15. 7) μm,菌核表面的菌丝排列也与此相仿。菌套类型为G。
横切面:菌丝套拟薄壁组织,厚度(27. 6 ± 2. 4) μm,分为2层,外层由深褐色菌丝促成,切面观菌丝排列规则,由圆形和长条形菌丝相间排列,圆形菌丝直径为(3. 9 ± 1. 0) μm,长条形菌丝可以看到分隔。单宁层由1~2层细胞组成,厚度小于30 μm,哈蒂氏网深入皮层细胞4~5层,平面观菌丝排列不规则。哈蒂氏网细胞颜色淡,有隔,壁厚,菌丝细胞椭圆形。
2.1.7 类型ⅦSebacina epigaea + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-7) 菌根单轴羽状分支,分支1~2级,菌根因子长2~12 mm,直径2~3 mm,不分支末端直,外延菌丝白色,稠密并形成垫状结构包裹于菌根外面,菌丝外分布有土壤颗粒,菌根本身为红锈色,有光泽,具根状菌索。表面观菌套较薄,不易剥离。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-18;图版Ⅱ-7) 菌套呈密丝组织状,菌丝排列紧密,无固定模式,表面观菌丝排列呈平行状,有一些菌丝束排列形成漩涡状隐约可见,菌丝细,壁薄,二叉状分支,表面有锥形囊状体,菌套表面粘有土壤颗粒,菌丝无隔,无锁状联合,且二叉状分支顶端有孢子的散发。
横切面:菌套为密丝组织,菌套厚,厚度达30~70 μm,分层,外层为薄薄的一层缠绕的菌丝,内层菌丝较厚,菌丝细胞不规则,染色较深,单宁层较薄,细胞组成为圆形或椭圆形,哈蒂氏网深入整个外皮层细胞间,由圆形菌丝细胞紧密的排列组成。
2.1.8 类型ⅧSebacina incrustans + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-8) 菌根系统单轴羽状分支到单轴金字塔形分支或不分支,菌根肥大,菌根因子长3~8 mm,直径3~4 mm,不分支的末端稍扭曲,顶端圆钝,幼时乳白色,成熟变为褐色,菌根因子有柄,长度2~3 mm,外延菌丝在菌根基部分布多且长,上部外延菌丝短,稀疏。表面观菌套厚,透明,易剥离。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-19; 图版Ⅱ-8) 菌套为密丝组织,排列相对疏松,菌丝二叉状分支,盘绕卷曲,单个菌丝或菌丝束盘绕形成似网眼状或像一莲花状,周围菌丝放射状排列,单个菌丝不规则膨大,似骨头状,菌丝分隔,壁薄,无锁状联合,色淡,细胞质均匀,菌套内表面呈拟薄壁组织,菌丝粘合紧密,平行排列,菌套类型为A和B。
横切面:菌丝套较厚,分层,外层菌丝为密丝组织,菌丝排列无规则,内层菌丝由圆形或椭圆形细胞组成,细胞排列相对紧密,单宁层较厚,分层,间断,在分层或间断的单宁层中间穿梭有由球形细胞组成的外生菌根菌丝,直接与皮层细胞中的哈蒂氏网连接,哈蒂氏网进入皮层细胞2~3层,分支比较规则。
2.1.9 类型ⅨSuillus luteus + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-9) 菌根系统单轴分支,0~1级,菌根因子长3~17 mm,直径1~2 mm,菌根直或稍扭曲,末端尖削,全株被有纯白色粉末,菌根本身为灰褐色,光滑,有光泽,无或少外延菌丝,无根状菌索。表面观菌套薄,不易剥离。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-20; 图版Ⅱ-9) 菌套外表面为拟薄壁组织,但因菌套表面被有土壤颗粒或白色粉末,菌丝不易观察,菌套内表面菌丝平行的、紧密的排列在一起,镶嵌于菌套的表面,表面观菌丝排列形成小溪状,且在某一点上汇合,菌丝有隔,但无锁状联合,菌丝壁厚,大于0. 3 μm,透明。
横切面:平面观菌套为拟薄壁组织,厚度25~25 μm,菌丝细胞为典型的圆形或椭圆形,排列紧密,细胞壁相对较厚,细胞质均匀,单宁层较薄,12. 5~15 μm,由圆形或椭圆形细胞组成,间断,菌丝细胞从间断处进入到皮层细胞3~4层,几乎达内皮层细胞,细胞组成也为圆形或椭圆形。菌丝未被染色,在皮层细胞间较明显。
2.1.10 类型Ⅹ Sebacina sp. + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-10) 菌根单轴金字塔形分支,分支2~3级,菌根锈褐色,顶端颜色稍淡,菌根因子长度为2~(16)20,直径1~2 mm,可能是菌根因子为阶段性生长,呈分节状,外观呈长的念珠状,最上端一节相对较粗大,颜色淡,菌根顶端圆钝,外延菌丝绒毛状,从白色逐渐到褐色或黑色,且菌丝上粘有土壤颗粒。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-21; 图版Ⅱ-10) 菌套为密丝组织,菌套外表面菌丝排列具一定模式,较紧密,多个菌丝束结合于一点,周围菌丝呈放射状排列,表面观呈一排排互相连接的小漩涡,且表面似乎分布有锥形囊状体。单个菌丝细胞纤细,壁薄,二叉状分支,菌丝无隔,无锁状联合,菌套内表面无太大的变化。
横切面:菌丝套较厚,分层,外层为密丝组织,内层为拟薄壁组织,菌丝细胞为圆形或椭圆形,细胞壁较厚,单宁层较厚,分为2~3层,间断,菌套菌丝细胞穿梭于其间,并与哈蒂氏网细胞联系,哈蒂氏网细胞由球形细胞组成。
2.1.11 类型ⅪCortinarius anisatus + Picea crassifolia1) 形态学特征(图版Ⅰ-11) 菌根系统叉状分支,菌根因子长度为3~20(22) mm,直径1~2 mm,菌根高度扭曲,整体呈扭曲的羊角状,菌根因子有柄,较短,末端尖削,顶端色淡,淡褐色到深褐色,有光泽,外延菌丝在幼嫩的菌根上为白色,膜状包于菌根外面,老化时菌丝变黑、变粗。
2) 解剖学特征(图版Ⅰ-22; 图版Ⅱ-11) 菌套为密丝组织,菌丝缠绕无固定模式,排列疏松,菌套外表面有锥形囊状体,菌丝细,二叉状分支,壁薄,细胞壁透明,菌丝无隔,无锁状联合。
横切面:平面观菌套薄,仅是几层密丝组织状菌丝缠绕在宿主植物根的外围,组成无固定的形态,单宁层细胞厚,约30 ~ 40 μm,间断,哈蒂氏网深入整个外皮层细胞间,末端达内皮层细胞,细胞组成为圆形或椭圆形。
2.2 不同类型比较不同类型外生菌根形态解剖学特征如表 1所示。
经对供试的11种不同类型外生菌根根尖材料DNA的提取,以及对其PCR扩增产物纯化后的克隆转化,测出供试外生菌根真菌rDNA上ITS区段的DNA序列,运用GenBank的序列局部相似性查询系统(BLAST) (Altschul et al., 1997),在GenBank + EMBL + DDBJ + PDB 4个DNA序列数据库中搜索与所测DNA序列相似的序列,并进行分析比较。BLAST查询的结果如表 2所示。
本研究在利用形态、解剖学方法分类的基础上,以菌根共生体的根尖为材料,提取DNA,利用真菌特有引物ITS1F和ITS4,并在PCR扩增的基础上对外生菌根真菌rDNA的ITS区段进行碱基序列测定,确定其外生菌根真菌的多样性,该方法在进行外生菌根分类鉴定中是切实可行的; 同时利用ITS区段DNA序列和互联网上的生物信息资源比对对外生菌根真菌进行分子鉴定,并把所测序列输入GenBank中,可以进一步丰富GenBank等DNA序列数据库中的生物信息,为外生菌根真菌rDNA上ITS区段的分子鉴定提供依据。对于青海云杉的11种外生菌根,BLAST查询结果显示其中7种菌根类型被鉴定到种的水平,相似率大于等于92%,其中类型Ⅲ (Helvella cf. acetabulum)、类型Ⅴ (Inocybe sp.)、类型Ⅹ(Sebacina)为92%,类型Ⅺ(Cortinarius anisatus)为95%,其余都为97%以上,而且类型Ⅵ (Cenococcum geophilum)、类型Ⅷ (Sebacina incrustans)、类型Ⅸ (Suillus luteus)都为99%;尽管有3种菌根类型比对结果相似率为92%,但经形态、解剖学鉴定及与BLAST查询结果中列出的两者同源性相比较,在所列出的score值中为最大,E值为0. 0,且在BLAST查询结果中列出的100个E值为0. 0的主要同源序列中其相似率最高; 所以在利用形态、解剖学方法分类的基础上进行分子鉴定,鉴定结果是可靠的、一致的。
在所分离11种菌根类型中,菌根系统从叉状分支到单轴羽状、单轴金字塔形及珊瑚状分支,颜色范围由近白色经乳白色到褐色及Cenococcum geophilum的黑色,本研究认为水分、土壤及其他环境条件好的区域,其外生菌根生长的比较粗壮、外延菌丝多且发达、根状菌索明显,而菌根的颜色、外延菌丝的形态、菌套表面的组织学特征等是由与树种共生的外生菌根真菌自身生物学特征来决定,而菌根的分支特征可能是由其宿主树种来决定。
Cenococcum geophilum形成的外生菌根,无论在哪一种寄主上,都有一些共同的特征,仅根据菌根的外观形态特征,就可以很容易地作出鉴定。本研究中,根据该菌在不同树种上形成的外生菌根的形态特征及分子测序鉴定,特别是菌根特征与前人在其他植物上的研究结果都相符,说明该菌的外部形态特征及菌核的特征不受寄主种类的影响,而是由其真菌本身来决定的。
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