板栗(Castanea mollissima)在山东省是一重要的干果树种。自2004年起，山东泰安、济南、潍坊、临沂等地相继发生一种新的叶部病害，板栗感病后，叶片上产生褐色的斑点，随后病斑迅速扩大，呈不规则大面积干枯，9月中、下旬开始大量落叶，10月中、下旬二次发芽抽稍，新发枝稍冬季枯死，极易诱发板栗疫病，引起树木整株死亡。近年来，该病逐年加重。2006年对泰安市徂徕山林场600 hm² 板栗林调查，发病率为100%，800余株10~15年生板栗树死亡，2007年死亡9 000余株，减产近12万kg。为控制该病害的危害，生产上迫切需要确诊出该病害及病原，2006—2009年，笔者对该病害进行了系统的研究，旨在为研究病害的发生发展规律和防治措施的制定提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 标本采集及病害症状观察

标本分别于2007年8月10日、11日、24日，2008年8月12日、25日采自山东泰安市徂徕山林场光化寺林区和茶石峪林区、泰山林场桃花峪林区3个板栗病害发生区，共12批次。

在体视显微镜下检查采集的病叶，观察分生孢子器在病叶表面的分布。选取具有典型症状的病叶标本，采用徒手切片法切取子实体，在显微镜下观察并拍照记录病菌分生孢子器和分生孢子形态，分别测量50个分生孢子器、分生孢子梗和100个甲、乙型分生孢子(从平板培养物上挑取)的大小。

1.2 病原菌分离

病原菌的分离和纯化采用组织分离法，前后12次分离共选择有典型病状的600个病斑，将新鲜的病叶用清水冲洗干净，用75%乙醇表面消毒，从其病健交界处用灭菌手术刀切取3~5 mm，置于PDA培养基上25 ℃恒温下培养，待菌丝长出后，进行转接纯化，并在PDA培养基上于25 ℃恒温培养，菌丝长满后，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 致病性测定

采用离体菌丝块及孢子液接种法对分离物中优势菌株(分离物编号BYD₁)进行致病性测定。

1) 室内离体接种  选取健康无病的新鲜叶片组织，用清水冲洗干净，75%乙醇消毒5 min，再用无菌水冲洗多次，置于事先灭菌的培养皿(直径150 mm，底部垫2~3层无菌纱布，并加入适量无菌水保湿)中。将PDA平板上培养5~7天的分离物用直径5 mm的打孔器在菌落边缘以内打菌饼，用无伤和刺伤进行接种(无伤接种是将菌饼直接贴接于叶片表面，刺伤接种用消毒昆虫针在健康叶片表面针刺后，将菌饼贴接于刺伤部位)。每处理接种5个叶片，每片叶接4个点，以无菌PDA琼脂块处理为对照。接种试验分8批次进行。置于智能型人工气候箱(仿照林间气候设置昼14 h，光照度50%，温度20~30 ℃，相对湿度40%~80%)培养。接种2天后移去菌丝块，观察发病情况。

孢子液接种的含量为15 × 40放大倍数下每视野10~20个孢子，接种量0.1 mL，用微量注射器将孢子液滴于叶片上，以接种等量无菌水为对照。处理重复数、接种点及接种后培养条件同菌丝块接种。根据柯赫氏法则，对发病的病斑再次分离，观察分离的病菌是否与原接种菌相同。

2) 林间接种  选择林间12~15年生的板栗，采用1)中接种方法将菌丝块及孢子液分别接种林间板栗叶片上，孢子液接种含量同1)，用毛笔蘸孢子液轻轻涂于叶上，每个处理10个叶片，并分别接种等量的PDA琼脂块及无菌水作为对照，保鲜袋保湿24~36 h后去掉，定期观察发病情况。林间接种共进行3次。根据柯赫氏法则，对发病的病斑再次分离，观察分离的病菌是否与原接种菌株相同。

1.4 病原菌的分子鉴定

选择不同批次分离纯化的5个菌株(BYD₁，BYD₂，BYD₃，BYD₄，BYD₅)，采用CTAB法提取和纯化菌株的基因组DNA，用真菌rDNA通用引物ITS1和ITS4进行ITS1-5.8S -ITS2基因片段的扩增，PCR产物经回收纯化后，连接载体pMDTM18-T (TaKaRa)，转化至大肠杆菌DH5α(Tiangen Biotech)，菌液法筛选阳性克隆，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

所得序列经NCBI进行碱基同源性分析，搜索相关序列27条，用MEGA 4.1 (maximum parsimony method; 1 000 replicates)软件构建系统进化树，分析该菌与其他相似菌株的系统进化关系，根据同源性比较结果，确定病原菌的系统分类地位。

2 结果与分析 2.1 病害症状及病原菌的形态

该病害主要为害叶片，在山东徂徕山，每年7月下旬至8月初，叶片上产生形状不规则，大小为2~3 mm的黑褐色的斑点，随后病斑迅速扩大为黄褐色、边缘不整齐、大小为2~3 cm的病斑。每个叶片上能产生多个病斑，病部中间浅黄褐色，边缘有较宽黑褐缘线(图版Ⅰ-A)。由于病斑扩大迅速，多个病斑易连片，以致使整个叶片上呈不规则的大面积焦枯状(图版Ⅰ-B)。8月下旬多数病斑面积扩展为整个叶片50%左右时，叶片开始脱落，9月中、下旬开始大量落叶，10月中、下旬2次发芽抽梢，新发枝梢冬季枯死，而且极易诱发板栗疫病，引起整株死亡。该病害突出的特点为病斑坏死组织扩展快，发病后整叶出现焦枯现象，叶片脱落严重。整个生长期间的病叶几乎不产生子实体，叶片脱落后在其正面产生很少散生子实体。

通过显微镜观察，该菌的分生孢子器散生，黑褐色，半埋生，单腔室，扁球形，有孔口，直径为224~361 μm(图版Ⅰ-C)。分生孢子梗无色细长，一次合轴分枝，极少数具1~2隔膜，长15~20 μm (图版Ⅰ-D)。分生孢子2种形状:甲型孢子无色，多为椭圆形，少数为披针形，具2个明显的油球，大小为(7~9) μm × (2~3) μm; 乙型孢子在PDA培养基无色，线形，单孢，直或一端弯曲状，无斑点，无隔膜，大小为(14~28) μm × (0.5~1) μm (图版Ⅰ-E)。在室内接种并产生子实体的病叶切片上，偶有发现乙型孢子。

2.2 病原菌的分离

对2007年、2008年3个采集点、12批600个病斑样品，经分离、纯化共获得1 324个分离物，依其培养性状和形态特征，进行合并分类，编号BY₁—BY₆，见表 1。

分离频率最高的分离物是BY₁，为明显的优势种，其次为BY₆，其他分离物频率均较低。在发病初、中期的多批次分离中，出现的频率较为一致。

2.3 致病性测定

选择分离频率较高的2个分离物进行致病性接种试验，其结果只有分离物BY₁有症状产生，分离物BY₆不致病。其接种结果见表 2。

表 2表明，BY₁分离物的2种接种材料均可产生病斑，以有伤接种孢子液发病率最高; 有伤接种孢子液和菌丝块，发病率均显著高于无伤口接种。用菌丝块接种一般5天后开始出现斑点(图版Ⅰ-F)，病斑初期暗绿色，水渍状，扩展1~3 cm黄褐色坏死斑后发展缓慢，多数病斑上25天左右产生很少量褐色子实体。孢子液接种后发病迅速，水渍状暗绿色的病斑15~20天扩展为整个叶片并干枯，25~ 30天在病叶上产生大量黑褐色子实体。林间接种产生的病斑少于室内离体接种病斑的数量，并和林间自然发病的病斑一样，在其脱落前也不产生子实体。无论是离体接种还是林间接种，对照均无发病症状，且离体接种的对照叶片在置于RXZ智能型人工气候箱20天保持绿色不萎蔫。从发病的病斑上再次分离的病原菌与原接种病原菌在菌落、分生孢子等形态特征上完全一致，证实BY₁为板栗褐缘叶枯病的致病菌，病菌主要通过伤口侵入。

2.4 病原菌分子鉴定

ITS序列分析利用真菌rDNA ITS的1对通用引物ITS1和ITS4，对BYD₁，BYD₂，BYD₃，BYD₄，BYD₅ 5个菌株进行PCR扩增，均扩增出600 bp左右的单一条带。通过测序得到该片段的碱基序列，大小均为584 bp。这5个菌株的rDNA序列之间的相似性为99.9%。将这些序列与GenBank中已有的真菌rDNA序列进行比对，选择与该菌株关系较近的27个菌株进行系统进化分析。采用Mega 4.1软件建树，使用系统默认参数，以菌种Saccharomyces cerevisiae为外群种，用MP法构建系统发育树，作1 000次重复，共454个位点性状，所测菌株的ITS序列单独聚成一支，支持率达到85%，能与形态近似种Phomopsis vaccinii，P. quercina，P. amygdali区分开。

根据病原菌的形态特征以及rDNA ITS序列同源性比较的结果，证明该病菌属于拟茎点霉属Phomopsis。

3 结论与讨论

通过对病害症状、病原菌形态观察和病原菌致病性研究，确定引起该板栗病害为一新病害，根据其症状特点定名为板栗褐缘叶枯病。经多次室内和林间致病性测定得出，BY₁为引起板栗叶枯病的致病菌，该病原菌在国内外未见报道，暂定名为板栗拟茎点霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae S. X. Jiang。

该病害与国内已定名的板栗黑(圆)斑病Cylindrosporium castanicola (谢宝多，1998;陆家云，2001)和Phomopsis castanea引起的叶斑病(戚佩坤等，2007)的症状及病原菌形态的描述菌有相近之处，但也有明显的差异:板栗黑(圆)斑病的病斑近园形，有黄色晕圈，其病原为Cylindrosporium属; P. castanea引起的叶斑病亦表现为叶片大面积干枯，但病原菌的形态的差异很大，P. castanea分生孢子器近球形或扁球形，(85~150) μm × (65~ 100) μm; 甲型分生孢子长椭圆形或纺锤形，无油球，(4~7) μm × (1~2.5) μm。同时，通过对病原菌分子鉴定，证明二者不是同一个种。在国外，由Phomopsis属真菌引起的板栗叶斑病的研究中，Kazempour等(2006)在伊朗报道了一种板栗病害，其症状为芽变黄褐色，叶上病斑呈椭圆形，导致叶子萎蔫; El-Gholl等(1996)在美国报道一种板栗病害，其病斑最大直径为9 mm，而且具有3个同心轮纹。上述板栗病害症状均与本项研究的病害症状存在较大差异。