东北红豆杉(Taxus cuspidata)具有很高的观赏价值、药用价值及保健价值(杨波等，2007)。红豆杉属植物种群竞争力弱，天然更新缓慢和地理分布局限等客观因素，导致其处于濒危状态，1999年被列为国家一级保护植物(叶水英，2006)。红豆杉属为雌雄异株，据周志强等(2009)对天然东北红豆杉种群生殖力进行调查研究结果，东北红豆杉天然种群中，雌雄性比为1：2，雌株和雄株的生殖生存特点不同; 张春雨等(2009)通过树木年轮学方法，发现雄株生长速率显著大于雌株，这可能是种群维持自身长期发展的一种适应。这说明东北红豆杉的性别分化及其机制有深入研究的价值。目前对于东北红豆杉性别的鉴定还停留在东北红豆杉雌株结实的阶段，还没有对东北红豆杉早期性别鉴定的有效方法。21世纪以来分子标记技术的应用为很多植物的遗传多样性以及性别相关基因的研究提供了可靠的技术支撑。Collins等(2003)运用RAPD(Cheng et al., 1997)技术分析了欧洲红豆杉(Taxus baccata)、加拿大红豆杉(Taxus canadensis)以及东北红豆杉种群间的亲缘关系; 邓俭英等(2007)用RAPD标记成功地扩增出2条与全雌性苦瓜(Momordica charantia)相连锁的特异性条带; 景建州等(2007)采用RAPD方法，筛选出与谭清苏铁(Cycas tanqingii)雌株高度相关的由随机引物S0465扩增出的1条大约500 bp的特异性带。本试验利用RAPD分子标记技术，寻找与东北红豆杉性别相关的分子标记，为东北红豆杉性别分化的研究和早期性别鉴定奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

在吉林省龙井市延边大学农学院和延边朝鲜族自治州农业科学研究所植物园内，选择东北红豆杉雌雄植株各10株，取干净的嫩叶迅速放入封口袋，密封，置于-70 ℃低温冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1) 东北红豆杉总基因组DNA的制备  采用改进的CTAB法(邵宏波等，1994)提取基因组总DNA，并用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和浓度，用1 × TE缓冲液将其稀释至10 ng·μL^-1，于-20 ℃冰箱中保存、备用。

2) RAPD扩增反应条件  建立20 μL反应体系，分别加入10 × PCR Buffer 2.0 μL，模板DNA10 ng，随机引物15 pmol·μL^-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，dNTP0.2 mmol·L^-1，Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1。PCR仪为PC-512型(Techne)。反应程序为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环; 最后72 ℃延伸10 min。引物为北京欣惠泽奥公司合成的245个随机引物。

3) 扩增产物的检测  PCR反应结束后，扩增产物在1.4%的琼脂糖凝胶上电泳2 h(缓冲液为1 × TBE)，电泳结束后，将凝胶平铺在凝胶成像仪的紫外透射灯上照相。

2 结果与分析 2.1 DNA模板的制备

DNA提取质量往往是RAPD分析成功的关键，用改良的CTAB法提取的东北红豆杉基因组DNA，样品色泽近白色或无色，总DNA电泳后呈现1条迁移率很小的整齐条带，无弥散的荧光出现，表明所提取的DNA样品较纯，DNA基本无降解，不含有RNA(图 1)。

2.2 RAPD特异性片段的筛选

利用245个10 bp随机引物对东北红豆杉雌雄株DNA进行扩增，结果显示:在245个引物中，有52个引物可以扩增出3条以上清晰的条带，其他引物扩增1~2条或者条带弥散。扩增条带较清楚的52条引物中共扩增出483条带，在雌、雄基因池中分别扩增出241和242条带。进一步重复试验表明，引物OPD15在雄株上扩增出1条1 300 bp左右的特异带(图 2，3)，且条带差异明显、易于分辨，3次重复的结果稳定一致。

3 结论与讨论

植物与动物一样有性别分化，而且很多植物(农作物、果树和经济林木)的产量及品质与性别有密切的联系，也就是说不同性别植物有不同的经济价值和经济效应，如麻类作物，其雄株纤维品质优于雌株，而以果实为收获对象的瓜果类作物，较多的雌花是获得高产的基础(娄群峰等，2002)。但植物的性别决定和组成比较复杂，研究历史较短，有很多植物性别分化及其相关因子以及性别应用价值需要探讨。分子标记技术是研究植物性别分化及调控研究的重要手段，现在很多植物已通过分子标记技术研究与性别相关基因，为性别分化机制及早期鉴别提供理论基础。

东北红豆杉是雌雄异株植物，对其性别研究还处于起步阶段。本研究以东北红豆杉雌、雄株2个DNA基因池作为PCR扩增反应模板，选用245个10 bp随机引物进行RAPD分析，结果表明:出现较明显谱带的48个引物中，1个引物在东北红豆杉雌、雄株基因组中出现差异性条带，其重复性很好。引物OPD15在雄株上扩增出1条1 300 bp左右的特异带，这条普带可能是与东北红豆杉性别紧密连锁的性别相关分子标记，为东北红豆杉性别早期鉴定以及克隆与性别相关基因奠定了基础。这个与性别相关的RAPD标记，其DNA序列能否作为候选性别鉴定探针或将其发展成PCR引物，还需要进一步分析验证。