热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物体受高温刺激而合成的一类应激蛋白，根据分子量的大小可分为HSP100s，HSP90s，HSP70s，HSP60s，smHSPs(small HSPs) 5大类(Waters et al., 1996)。各类HSPs在植物体内普遍存在，其中又以smHSPs最为常见。smHSPs是由核基因编码的一类分子量为15~42 ku的HSPs，其典型特征是C端有1个高度保守的ACD(α-crystallin domain)结构，能够快速地对热激刺激产生响应。早期的研究者根据DNA序列相似性分析、免疫交叉反应以及胞内定位方法将smHSPs分为5类，其中2类定位于细胞质，即细胞质Ⅰ类和细胞质Ⅱ类smHSPs，其余3类分别存在于叶绿体(chlorplastid，CP)、内质网(endoplasmic reticulum，ER)和线粒体(mitochondria，Mt)中(Waters et al., 1996; Sun et al., 2002; Wang et al., 2004)。在随后的研究中又发现了第6类smHSPs，这是一类定位于过氧化物酶体(peroxisomes，Po)的smHSPs(Ma et al., 2006)。除高温外，smHSPs还能被低温、激素、高盐、干旱以及机械损伤等多种胁迫环境条件诱导(Chang et al., 2007; Zou et al., 2009)，亦能受种子萌发、花药发育及果实成熟等过程调控(刘箭等，2001; Kotak et al., 2007; Liu et al., 2006; Giorno et al., 2010)。复杂的表达模式可能与其所承担的多样的生物学功能密切相关。目前认为smHSPs主要具有分子伴侣功能，能在不依赖ATP的情况下阻止变性蛋白的累积、保护蛋白的正确折叠，对植物抵抗、适应胁迫环境以及生长发育起着重要作用(Mamedov et al., 2008; Timperio et al., 2008)。通过转基因手段让smHSPs在细胞内超表达可以显著提高植株的耐热性、抗冷性、抗盐性及抗旱性等多种抗性(Jiang et al., 2009; Sanmiya et al., 2004; Sun et al., 2001; Wang et al., 2005)。

蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus)落叶丛生灌木，隆冬开花，素有“三耐”(耐寒、耐旱和耐剪)与“三不”(冻不坏、旱不死和不缺枝)的美誉。其高效的逆境防御机制涉及大量抗逆基因的协同作用，热激蛋白是否参与其中并发挥某些关键性的作用是一个值得探讨的问题，因此从作者所在实验室已经构建好的蜡梅花cDNA文库(眭顺照等，2007)中克隆了1个热激蛋白基因cDNA序列，在对其进行序列特征和进化分析的基础上，通过转录水平的表达分析，研究该基因的组织表达情况及其在非生物胁迫处理下的响应特征，为进一步探讨该基因的生理功能奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

试验所用植物材料为罄口蜡梅(Chimonanthus praecox var.grandiflora)。蜡梅花cDNA文库由重庆市花卉工程技术研究中心构建保存(眭顺照等，2007)。多年生蜡梅以常规方式进行种植养护。蜡梅四叶期幼苗用种子繁殖，种子催芽后置于人工气候箱中培养(温度:昼25 ℃/夜20 ℃; 湿度: 85%;光周期:昼16 h/夜8 h; 光照强度:20 000 lx)。

1.2 目标克隆子的获得及序列分析

参考谢树章等(2009)的操作，采用随机克隆测序的方法来获取目标基因。生物信息分析主要采用DNAMAN4.0和DNAStar7.0软件包进行。

1.3 总RNA提取与cDNA合成

选取长势一致的3株蜡梅幼苗，在同一植株上分别采集根、茎、嫩叶以及子叶; 选取处于花期的3株无病虫害蜡梅，在同一植株上分别采集成熟叶、不同时期(萌动期、蕾期、露瓣期、初开期、盛开期和落花期)(吴昌陆等，1995)花芽及盛开期花芽不同花器官(外瓣、中瓣、内瓣、雄蕊和雌蕊); 选取长势一致的蜡梅幼苗分别进行高温(42 ℃)、低温(4 ℃)、高盐(1 mol·L^-1 NaCl)、ABA (50 μmol·L^-1)和重金属(1 mmol·L^-1 CuSO₄)胁迫处理，在处理0，0.25，1，6和12 h后，分别取3株幼苗相同部位的嫩叶。用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(天根)分别提取上述采集材料的总RNA，然后以1 μL总RNA为模板，按PrimeScript^® RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒(TaKaRa)的方法合成cDNA第1链。

1.4 基因表达特性分析

使用SYBR Green Ⅰ荧光染料法，在CFX96(Bio-Rad)实时荧光定量PCR仪上对CpHSP1基因在蜡梅不同组织、不同花期花芽和不同胁迫下幼苗嫩叶中的表达情况进行实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)分析。选取蜡梅Tublin和Actin-b基因作为目标基因定量表达的双内参基因(表 1)。根据SsoFast^TM EvaGreen^® Supermix试剂盒(Bio-Rad)说明配制反应体系，每个样品设3个重复。反应体系中含有5 μL SsoFast EvaGreen Supermix，上下游引物(10 μmol·L^-1)各0.5 μL，模板(50 ng·μL^-1)0.5 μL，ddH₂ O 3.5 μL，总体10 μL。反应程序:98 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s，59 ℃退火/延伸5 s(每次循环后采集荧光)，40个循环; 95 ℃变性10 s，65~95 ℃做熔解曲线分析，每个温度以每步0.5 ℃上升，每个温度停留5 s。试验数据通过Bio-Rad Manager^TM Software(Version 1.1)进行分析，用2^-△△C_T法(Livak et al., 2001)获得CpHSP1的相对表达量。

2 结果与分析 2.1 CpHSP1克隆子的获得及其序列特征

随机克隆测序后的EST分析显示，EST序列EST0150对应目标克隆子CH0328上的cDNA片段可能为热激蛋白基因，以SP5和T7为测序引物的测序结果初步表明该克隆子是源于蜡梅的热激蛋白cDNA，命名为CpHSP1(GenBank登录号: HQ894379)。

分别以CH0328质粒DNA、蜡梅基因组DNA和蜡梅花cDNA为模板进行PCR扩增，得到大小一致的特异产物，测序结果也完全一致，表明CpHSP1全长DNA序列没有内含子。CpHSP1全长cDNA序列为790 bp，包含126 bp的5'-UTR区(5'-untranslated region)，477 bp的ORF(open reading frame)和187 bp的3'-UTR区(3'-untranslated region)。同时，在3'-UTR区中有2个典型的poly(A)加尾信号AATAAA以及1个26 bp的poly(A)结构。

2.2 CpHSP1编码蛋白特征分析

1) CpHSP1蛋白结构特征  CpHSP1蛋白理论分子质量约18.13 ku，由158个氨基酸组成，其中碱性氨基酸27个，酸性氨基酸28个，极性氨基酸28个，疏水氨基酸53个，预测的等电点为6.441，C + G含量为53.67%。运用SPOMA和SW ISS-MODEL进行在线预测，结果显示CpHSP1蛋白的二级结构由α螺旋(α-helix，22.78%)、β转角(β-turn，6.33%)、延伸链(extended strand，20.25%)和大量的随机卷曲(random coil，50.63%)组成; CpHSP1蛋白的三级结构则具有用X2射线衍射测定的ACD结构，能够迅速响应热激刺激。

2) CpHSP1蛋白同源比对  在NCBI网站上进行BLASTP搜索，显示CpHSP1蛋白与其他多个细胞质Ⅰ类smHSPs同源性较高，其中与烟草(Nicotiana tabacum)和紫茎泽兰(Ageratina adenophora)的细胞质Ⅰ类smHSPs同源性最高，均为78%。将CpHSP1蛋白与其他植物的细胞质Ⅰ类smHSPs进行多序列比对(图 1)，发现其C端高度保守，具有Waters等(1996)报导的ACD保守结构的Ⅰ(Pro-X₍₁₄₎-Gly-Val-Leu)和Ⅱ(Pro-X₍₁₄₎-X-Val/Leu/Ile-Val/Leu/Ile)2个保守域，N端差异较大但仍含有前人研究中(Waters，1995)提到的细胞质Ⅰ类smHSPs特有的保守区。因此，推定CpHSP1蛋白属于细胞质Ⅰ类smHSPs。

3) CpHSP1蛋白聚类分析  将CpHSP1蛋白序列与其他一些双子叶和单子叶植物的多条smHSPs序列构建进化树。结果(图 2)显示:20个smHSPs分处于6个大的分支，与文献(Ma et al., 2006)中描述的植物smHSPs分为6类的结果一致，CpHSP1和大豆、棉花、拟南芥的smHSPs聚在一起，属于细胞质Ⅰ类smHSPs。此外，由进化树还可以看出，不同类smHSPs即使在同一植物中的同源性也较低，这与Waters等(1996)的研究结果十分吻合。

2.3 CpHSP1表达特性分析

1) CpHSP1在茎中的优势表达  CpHSP1在蜡梅不同组织中均有表达，其转录产物在茎中最多(图 3)，具有较强的组织特异性，推测该基因影响着茎的相关生理功能，可能参与了茎的形态建成，在体内水分、无机盐及有机物的运输和积累中发挥了某些关键性的作用。

2) CpHSP1在花芽中的表达CpHSP1在蜡梅单花开放过程中呈现出连续的波动态表达模式，其转录水平具有较强的时间特异性。如图 4所示，从蕾期到盛开期，伴随着花色的不断加深、花香的逐渐加浓，CpHSP1在蜡梅花中的表达量呈现出增加的趋势; 落花期，由于花香丧失、花色转淡，CpHSP1的表达量也快速下降。因为花色、花香分别受到花色素苷含量和蜜腺发育的调控，所以推断CpHSP1的表达与花色素苷的含量以及蜜腺的发育存在着某种联系。Dafny-Yelin等(2008)在对香云月季(Rosa hybrida ‘Fragrant Cloud’) RhHSP17.5-CI的研究中也得到了类似的结果。蜡梅花芽萌动时正值秋末冬初，气温骤降，此时花芽内CpHSP1的高水平表达，可能是蜡梅的一种保护机制，其目的在于启动相关调控网络来防御低温、增强花器官的抗寒性。

CpHSP1在蜡梅3轮花器官中差异表达，花瓣中的表达量明显高于雄蕊和雌蕊(图 5)。说明该基因可能参与了花瓣发育的调控，但是否也对雄蕊和雌蕊的发育起决定性作用则有待进一步研究。

3) CpHSP1在不同胁迫下的表达CpHSP1在不同胁迫处理的蜡梅幼苗嫩叶中都能够被诱导表达，但其表达变化各不相同(图 6)。高温处理后，CpHSP1的转录水平远远高于其他几种处理，这与Jiang等(2009)对月季的研究结果相似。由此可见，CpHSP1在蜡梅幼苗中的表达受到高温、低温、ABA、高盐和重金属的正调控作用，而且对高温胁迫更为敏感，可能在蜡梅幼苗受到环境胁迫特别是高温胁迫时发挥着重要的防御作用。

3 讨论

从蜡梅花cDNA文库中克隆到了热激蛋白基因CpHSP1，通过生物信息学分析证实其属于细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因。早期的许多研究认为在没有环境压力的情况下，smHSPs不会在植物的营养器官中表达(Schubert et al., 2002; Sun et al., 2002)，有研究者认为这是由于Northern方法不够灵敏无法对低丰度表达的RNA进行检测所致(Zhang et al., 2003)。随后的研究证实许多smHSPs即使没有受到环境胁迫也能在植物营养器官中表达，如陆地棉(Gossypium hirsutum ‘No.7235’)中的4个小热激蛋白基因至少能在根、茎、叶中的一个组织中有所表达; 水稻(Oryza sativa ‘Tainung No.67’)中存在着呈组成型表达的细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因，紫茎泽兰中也有类似的发现(贺亚军等，2008; 杨娟等，2009; Guan et al., 2004)。CpHSP1在蜡梅的不同营养器官和生殖器官中有不同程度的表达(图 3)，但与一些细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因在根或是花中优势表达的模式不同，CpHSP1在茎中的表达量明显高于其他组织。这是否意味着CpHSP1具有某些有别于其他细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因的特殊功能，还需要进一步的研究来证实。

同其他的HSPs一样，smHSPs的典型特征就是能受热胁迫诱导(Jiang et al., 2009; Schubert et al., 2002)。但即使是同一植物的同类smHSPs对热激刺激也没有固定的响应模式。相同高温处理后，水稻9个细胞质Ⅰ类smHSPs的mRNA无论是开始积累的时间还是到达峰值的时间都各不相同(Guan et al., 2004)。这可能是由于不同smHSPs对热激信号有各自不同的调控途径所致(Zou et al., 2009)。除了热胁迫，其他许多外源信号也是smHSPs表达的诱因，但这些因子往往不具有普遍性。水稻OsHSP23.7 mRNA的合成受到高盐诱导，OsHSP24.1能被PEG诱导，但它们都不能被低温诱导(Zou et al., 2009)。CpHSP1在蜡梅幼苗嫩叶中的表达受高温、低温、ABA、NaCl和CuSO₄等处理不同程度的诱导作用，这暗示CpHSP1在蜡梅幼苗对环境胁迫的防御过程中发挥着重要的作用。CpHSP1在蜡梅整个花期中呈现出的连续波动态表达模式(图 4)，可能是蜡梅花对冬季低温胁迫的响应，或许与蜡梅花抗寒性的形成相关，但具体机制有待进一步研究。考虑到蜡梅属于多年生木本植物，与草本植物相比，在进行活体研究时存在着诸多操作上的不便，本实验室正尝试通过瓶插培植蜡梅鲜切花的方式来进行相关转录水平的分析。