花粉萌发、花粉管生长是植物有性生殖的重要环节，包含许多复杂的生理过程。微丝是细胞骨架重要组成成分，很多研究表明微丝在花粉萌发、花粉管内原生质流动(Justus et al., 2004)、花粉管顶端生长(Li et al., 2001)等方面具有重要的作用。花粉管是极具代表性的顶端生长细胞，所以是研究微丝骨架调控细胞生长机制的理想材料。目前关于花粉与花粉管中微丝骨架的研究结果多数是以被子植物为材料观察所得，而关于裸子植物微丝骨架的研究报道较少，主要集中在欧洲云杉(Picea abies)(Lazzaro，1996)，黑松(Pinus thunbergii) (李国平等，2006)和银杏(Ginkgo biloba) (Liu et al., 2005)。

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国特有树种，也是我国重要的用材树种。同时由于裸子植物与被子植物在生理活动和进化上存在差别，其细胞骨架的分布也可能有所差异。本研究采用杉木花粉为试验材料，通过荧光探针标记对杉木花粉萌发过程中的微丝骨架进行研究，为深入探究裸子植物受精过程提供参考，为林木育种研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 花粉采集与保存

2007，2008年3月中上旬在南京林业大学树木园采集即将散粉的杉木小孢子，用70%酒精灭菌20 s，0.1% HgCl₂灭菌5 min，用无菌水洗3次，无菌滤纸吸干，放入灭菌干燥小瓶，置于放有干燥剂的容器中，用硅胶干燥后分别于4 ℃和－ 20 ℃下密封保存待用。

1.2 花粉及花粉管中荧光标记观察

花粉从冰箱内取出，均匀撒在10%蔗糖、0.004%硼酸，pH5.8培养基上，在26 ℃下萌发。从培养基中取出萌发花粉，参照Lazzaro(1996)、李岩等(1998)的方法，对微丝进行荧光标记:将萌发的杉木花粉用浓度为4%多聚甲醛固定1 h，同时抽气5 min; 50 mmol·L^-1 Pipes缓冲液洗涤，重复3次，每次10 min; 用0.33mmol·L^-1 phalloidin-TRITC于28 ℃暗染1 h，4 ℃过夜; 50%甘油(PBS缓冲液配制)封片; Leica TCSSL共聚焦激光扫描系统进行观察。

2 结果与分析

杉木花粉撒入培养基后呈圆球状。随后花粉开始膨大，胀破外壁外层后继续膨大。培养20 h，有的花粉出现明显的小突起，培养24 h后有的花粉管开始生长。此后花粉管继续伸长，约3天花粉管可达200 ~ 250 μm。随着花粉的继续培养，花粉管伸长生长减缓甚至破裂，花粉管顶端膨大变圆。

2.1 花粉萌发过程中微丝骨架的动态变化

用phalloidin-TRITC染色和激光共聚焦扫描显微镜观察后，发现在杉木花粉萌发的不同时期，其内的微丝分布各不相同。在水合膨大的花粉中微丝骨架主要存在于生殖细胞及管细胞附近(图版Ⅰ-1)，随后在活化的花粉中有粗微丝开始向细胞质中分散，管细胞开始移动(图版Ⅰ-2)，在花粉管伸出后，粗微丝束开始向伸出花粉管的萌发孔处延伸，并随之进入伸长的花粉管内，构成浓密的微丝网络(图版Ⅰ－ 3，4); 在多数花粉管中粗微丝束主要是分布在花粉管近中央区域，可以看出粗微丝束的走向与花粉管伸长的方向一致(图版Ⅰ-5)，同时在少数花粉管中粗微丝呈螺旋状分布(图版Ⅰ-6); 花粉管顶端的区域内看不到明显的粗微丝束，同时在花粉管顶端明显的标记荧光表明在花粉管顶端存在由细小微丝组成的浓密微丝网络，在多数花粉中这一微丝网络与亚顶端区域的粗微丝束连接成一个连续的循环微丝结构(图版Ⅰ-11)。但在部分花粉管顶端附近也发现了含有微丝中空区域的顶端微丝网络结构，甚至于在某些花粉管的分枝中这2种顶端结构并存(图版Ⅰ-12)。

2.2 花粉粒和花粉管中循环微丝束

在杉木花粉及花粉管中也发现类似被子植物的循环微丝。在水合萌发的杉木花粉粒中发现有循环的微丝束，这些循环的微丝束由分布在质膜下的一束或多束微丝束形成的环状结构构成(图版Ⅰ-7)。花粉管伸长后，在花粉粒与花粉管相对的质膜下仍会有环状微丝束(图版Ⅰ-8，(9)，同时在伸长的花粉管中也会存在循环的微丝束(图版Ⅰ-10)。从花粉粒延伸到花粉管中的微丝束在管核处开始形成2股明显的粗微丝束，这2股微丝束延伸到花粉管亚顶端，与顶端的浓密的微丝网络连接成一个连续的循环微丝结构(图版Ⅰ-11，12)。

3 讨论 3.1 杉木与被子植物和其他裸子植物花粉及花粉管中微丝骨架分布的比较

杉木花粉萌发过程中微丝分布变化与被子植物及多数裸子植物花粉萌发过程中微丝骨架分布相似。但杉木花粉及花粉管内微丝分布与被子植物及某些裸子植物也存在差异，如在银杏花粉中微丝明显聚集在膜上(Liu et al., 2005)，而在杉木花粉内微丝束主要是绕核分布，只有少数微丝束与膜连接。过去相关研究表明:在大多数被子植物花粉管中，微丝束主要位于花粉管主干部分靠近质膜的区域(Yu et al., 2006; 王晓华等，2007)，并且还存在周质微丝。但在部分杉木花粉管中微丝束以螺旋方式排列，而且在部分杉木花粉管中粗微丝束集中分布于花粉管中央，花粉管内周质微丝分布较少。在杉木花粉萌发后期，微丝数量会减少，主要存在连接生殖细胞与管细胞的粗微丝束，这一现象目前在其他裸子植物中未见报道。

杉木花粉管顶端微丝分布与被子植物花粉管顶端不同，被子植物花粉管顶端不存在浓密的微丝网络，但有较多的单体肌动蛋白(王晓华等，2007; Fu et al., 2001)。并且Li等(2001)对川百合(Lilium davidii)花粉管中循环微丝观察发现，循环微丝束在接近花粉管顶端10 ~ 20 μm处开始折回。而在杉木花粉管顶端存在由细小微丝组成的浓密微丝网络层。但杉木花粉管的微丝分布与另一种裸子植物———欧洲云杉相比也不尽相同(Lazzaro，1996; Fernando et al., 2005)。多数杉木花粉管顶端存在由微丝网络层与亚顶端区域的粗微丝束连接成的类似于被子植物的一个连续的循环微丝结构。而且本研究发现，只有在少数杉木花粉管顶端区域会存在与欧洲云杉花粉管顶端类似的由微丝网络层包裹的中空区域。

3.2 花粉粒和花粉管中循环微丝束

花粉管内原生质的流动研究已有很长的历史。人们推测花粉管内原生质的流动本质是基于肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用。Li等(2001)对百合花粉和花粉管内微丝研究发现花粉及花粉管内连续循环排列的微丝束，并认为循环微丝与原生质双向流动存在密切关系。在本研究中杉木花粉和花粉管中也发现了类似于被子植物的循环微丝。被子植物的循环微丝在花粉粒和花粉管中是由1个或数个由多圈微丝束形成的微丝环组成，在花粉管生长后，这些微丝环随花粉管不断伸长，其循环微丝的长度逐渐加长，并延伸到亚顶端。在顶端主要以G-actin为主，只有少量的F-actin(Li et al., 2001; Wang et al., 2005)。但在杉木花粉及花粉管中循环微丝有其特点:首先在杉木花粉粒中循环微丝束的数量少，并且也没有被子植物花粉中循环微丝明显; 其次微丝从杉木花粉内生殖细胞处发散，延伸到管细胞后开始形成2股明显的粗微丝束，并延伸到花粉管亚顶端，与花粉管顶端细小微丝纤维组成的浓密微丝网络层构成一个循环结构。

3.3 花粉微丝密度差异与不同植物花粉间生理差异关系初探

裸子植物的花粉具有萌发时间长、生长慢的特性，这可能与其内微丝的分布具有一定的联系。杉木花粉及花粉管的微丝束与一些被子植物的研究结果相比较发现，如百合花粉内微丝束(Li et al., 2001)，在相同的试验方法下，百合花粉及花粉管中微丝束密度要大于杉木花粉及花粉管内微丝束密度。研究认为在顶端生长的花粉细胞中，花粉管中的微丝分布对花粉管的极性生长有重要的作用。在花粉管生长过程中细胞器的运输主要以微丝骨架为轨道并以微丝马达蛋白推动，比如运送生长所需的原材料到亚顶端的区域。而顶端密集的精细微丝网络的作用可能是抵御胁迫、运送分泌小泡和促使小泡定位于顶端等。同时研究表明裸子植物与被子植物花粉中肌动蛋白含量存在差别。张红等(1997)对银杏花粉与玉米(Zea mays)花粉肌动蛋白含量的比较研究表明，银杏花粉肌动蛋白含量为玉米花粉肌动蛋白含量的1 /7。同时Fernando等(2001)报道了松科(Pinaceae)植物花粉萌发和花粉管生长均伴随有新蛋白的合成，而且在花粉管伸长时缺乏某些蛋白质可能是裸子植物花粉管生长慢的原因之一。而白杄(Picea meyeri)花粉微丝骨架研究也说明裸子植物白杄花粉萌发与伸长，需要actin的不断合成(Chen et al., 2006)。所以裸子植物花粉中肌动蛋白的缺乏可能是影响花粉萌发与花粉管生长的主要原因之一。因而推测被子植物和裸子植物花粉中肌动蛋白量的差异可能使得二者微丝束密度出现差异，这种微丝束密度的差异最终可能会导致裸子植物花粉管生长所需物质不能及时的运输，影响花粉管生长速率。

由此可见，裸子植物与被子植物花粉间既存在微丝分布差异也存在微丝密度的差异，这些差异和裸子植物与被子植物花粉之间生理功能上的差异以及裸子植物与被子植物物种的进化程度的差异是否有一定的联系还需进一步研究。