茶树起源于中国西南，滇、桂、黔毗邻地区为起源的中心(闵天禄，1992)，广西正处在这个起源中心的边缘，其气候夏长冬暖、炎热多雨，极适宜于各种类型的山茶科(Theaceae)植物的生长，茶树种质资源非常丰富。在全国茶叶生产区划中，广西被列为最适生长区(陈宗懋，2007; 陈亮等，1996)。在国家种质杭州茶树圃保存的2 665份种质资源中，来自广西的种质资源为149份(陈亮等，2004)，仅次于云南、福建、浙江，位列第4。广义的茶树包含山茶属茶组[Camellia L.Sect.Thea (L.) Dyer]所有种和变种，目前茶组植物分类系统主要有席勒系统(Sealy，1958)、张宏达系统(张宏达，1981a; 1981b; 1984; 1990)、闵天禄系统(闵天禄，1992)等。广西茶树种质资源除桂西有一些大厂茶(C.tachangensis Chang)和厚轴茶(C.crassicolumna Chang)外，基本上属于茶(C.sinensis (L.) O.Kuntze)和白毛茶(C.sinensis var.pubilimba Chang) (陈亮等，2006)。广西拥有很多历史悠久的地方品种及名茶，如‘苍梧六堡茶’、‘贺州开山白毛茶’、‘武宣金龙茶’、‘昭平象棋茶’、‘资源云雾茶’、‘钟山雷电茶’、‘三江牙己茶’等(陈宗懋，2007)。据统计，到2010年底全国通过国家审(认、鉴)定的茶树品种有123个，而广西仅有‘桂红3号’、‘桂红4号’、‘桂绿1号’、‘尧山秀绿’和‘桂香18’5个国家级无性系良种; 通过省级审(鉴)定的品种有150多个(Chen et al., 2007)，广西仅有‘桂热1号’、‘桂热2号’2个。茶树地方品种资源在新品种选育中有很大的潜力，而对其进行准确和有效的遗传多样性和遗传结构分析，是茶树遗传改良利用的前提。

SSR (Simple Sequence Repeat)标记以其多态性高、重复性好、可靠性高、操作简单等优点，已成为大豆(Glycine max)、番茄(Solanum lycopersicum)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)等作物遗传育种研究的最重要方法之一(吴晓雷等，2001; He et al., 2003; Gupta et al., 2003; 朴红梅等，2007; Gao et al., 2008)，在茶树遗传研究中得到越来越广泛的应用(Freeman et al., 2004; 金基强等，2007; Kaundun et al., 2002; Ohsako et al., 2008; Zhao et al., 2008; Sharma et al., 2009)。刘振等(2008; 2009)、姚明哲等(2009)通过EST-SSR (Expressed Sequence Tag based SSR)技术对我国云南、四川、贵州、福建等省份的茶树种质资源进行了比较详尽的遗传多样性研究，而对毗邻的广西茶树地方品种资源未见系统的研究报道。本研究利用EST-SSR标记分析了广西茶树地方品种的遗传多样性和遗传结构，比较并分析了茶与白毛茶变种的遗传差异，为更好地利用和改良广西茶树地方品种提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

共选用了原产于广西有代表性的51份茶树地方品种(表 1)，分类上均为茶(C.sinensis (L.) O. Kuntze)，其中白毛茶(C.sinensis var. pubilimba Chang)31份。用于DNA提取的一芽二叶鲜叶采自中国农业科学院茶叶研究所的“国家种质杭州茶树圃”，样品采集后经液氮迅速冷冻处理，保存于-70 ℃冰箱中备用。

1.2 试验方法 1.2.1 DNA提取

采用改进的SDS法(陈亮等，1997)分别提取51个地方品种的基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，ND-1000 UVVis分光光度计(Nanodrop Technologies，Inc.，Wilmington，DE，USA)检测DNA浓度后，稀释部分DNA原液到10 ng·μL^-1的工作浓度，用于PCR扩增，剩余原液-20 ℃保存备用。

1.2.2 EST-SSR引物的选择

所用的60对ESTSSR核心引物重复性好、扩增条带清晰稳定、具多态性，其中59对由本实验室设计、筛选(乔婷婷等，2010)，1对为Freeman等(2004)发表，作为参照引物，标记为Camsin M5 (表 2)。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增及其产物检测

SSR-PCR反应体系与反应程序参照刘振等(2008)的方法，在BioRad PTC-220型PCR仪(MJ Research，Inc.，Waltham，MA，USA)上进行PCR扩增。扩增产物中加入2 μL的上样缓冲液(loading buffer)，用10%的聚丙烯酰胺凝胶，在CBS垂直电泳系统(C.B. S.Scientific Company，Inc.，San Diego，CA，USA) 150 V电压下电泳90 min。电泳后参照Charters和Wilkinson(2000)的方法银染显色。Bio-Rad Gel Doc 2000 (Bio-Rad Laboratories，Inc.，Philadelphia，PA，USA)凝胶成像仪拍照记录。

1.3 数据统计

EST-SSR为共显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，其显带的记录方法为:电泳图上目的片段范围内，清晰、重复的条带，根据分子质量大小，从大到小依次记作A，B，C，D……，1条为纯合，2条为杂合，分别记录为aa，ab，bb，ac，ad，cd等，按照等位基因的位置不同而不同，从而获得原始的数据。

1.3.1 遗传多样性及遗传分化分析

利用Popgene version 1.32软件(http://cc.oulu.fi/~jaspi/popgen/popdown.htm)计算在物种水平和群体水平的等位基因数(N)、Shannon信息指数(I)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)，以及遗传分化的固定指数(F_it，F_st，F_is)，即总近交系数F_it、种群分化系数F_st和种群内的近交系数F_is。利用Powermarker 3.25软件(http://www.powermarker.net)计算Nei基因多样性(H)和多态信息含量(PIC) (Liu et al., 2005)。

1.3.2 聚类分析

利用PowerMarker 3.25软件，基于Nei’s遗传距离(Nei，1973)进行Neighbor-Joining聚类分析，构建无根树状聚类图。

1.3.3 遗传结构分析

采用Structure 2.0软件(http://pritch.bsd.uchicago.edu/software)分析群体的遗传结构(Pritchard et al., 2000)，假定试材的群体数目(K)为2~9，将迭代周期(length of burnin period)和MCMC (Markov Chain Monte Carlo)各设为10 000次，重复3次计算，重复得到一致的结果，然后根据似然值最大的原则选取1个合适的K值。

2 结果与分析 2.1 遗传多样性分析

应用60个EST-SSR标记在广西51个茶树地方品种资源中，共检测到233个等位基因，平均每个位点约有3.88个等位基因。如表 2所示，TM154位点的等位基因最多，有7个; 位点TM142，TM144，TM149，TM180的等位基因数最少，为2个。对于整个群体，群体的观测杂合度(H_o)变化范围为0.02 (TM149)~0.92 (TM186)，平均为0.37;期望杂合度(H_e)的变化范围为0.13(TM144，TM147)~0.73 (TM189)，平均为0.47。Shannon信息指数(I)为0.18(TM144)~1.42 (TM169)，平均为0.82。所使用的60个微卫星标记的多态性信息含量(PIC)为0.12~0.68，平均为0.41。根据Botstein等(1980)的理论，有8个标记为低度多态位点(0 < PIC < 0.25)，33个标记为中度多态位点(0.25 < PIC < 0.5)，其他19个为高度多态位点(PIC > 0.5)，TM169位点PIC最高为0.68，TM144，TM147位点PIC最低为0.12，其他位点的PIC值见表 2。

2.2 聚类分析

广西51份地方品种的亲缘关系聚类如图 1所示，全部品种聚为3类:第Ⅰ类共有24份，包含了桂林(7份)、来宾(3份)和贺州(2份)的大部分品种，钦州(4份)和梧州(3份)的全部品种，还有少部分来自百色(1份)、崇左(1份)、防城港(1份)、贵港(1份)和柳州(1份); 第Ⅱ类共有13份，来自崇左(3份)、桂林(3份)、贺州(2份)、来宾(2份)、南宁(2份)和柳州(1份); 第Ⅲ类包含14份品种，主要来自崇左(5份)、防城港(7份)，还有部分来自南宁(2份)。

另外，茶与白毛茶在3大类群中的分布见图 2，茶与白毛茶在各类群中穿插分布，茶主要分布在第Ⅲ类; 白毛茶主要分布在第Ⅰ，Ⅱ类，且第Ⅱ类以白毛茶为主。

2.3 遗传结构分析

利用Structure 2.0软件对广西51份茶树地方品种进行遗传结构分析，当K=3时，能够取得最大的lnP(D)值和比较稳定的α值。即广西茶树地方品种可分为3个类群(图 3) :类群A主要由桂林、钦州、贺州和梧州的组成; 类群B包含了多数地区的品种; 类群C包含了防城港、崇左和南宁的大部分品种。各地区在遗传结构图中的具体分布如表 3所示。茶与白毛茶在各类群中的分布如图 4所示，茶主要分布于类群C，白毛茶主要布于类群A和B。基于模型和遗传距离的分析结果基本一致，广西南部(崇左、防城港和南宁)的茶树地方品种和北部(桂林、钦州、梧州和来宾)的品种分别聚在一起，茶与白毛茶在各类群中穿插分布。

2.4 地区间遗传多样性和遗传距离分析

为了进一步明确地区间的遗传差异，对广西8个主要地区共47份茶树地方品种的平均观测杂合度和平均期望杂合度进行分析(表 4)。就各地区而言，其平均期望杂合度在0.42(梧州)~0.48(南宁)之间，平均观测杂合度0.34(钦州)~0.40(来宾)之间，Shannon信息指数在0.55(梧州)~0.72(崇左，防城港)之间，说明地区间的遗传差异较小。8个地区间的亲缘关系见图 5，来源于梧州和钦州的地方品种聚为一类; 南宁、崇左及防城港的先聚为一小类，再与桂林和来宾聚为一类; 贺州单独为一类。

2.5 茶与白毛茶遗传多样性和遗传分化分析

茶与白毛茶的遗传多样性比较分析结果表明:茶的I，PIC和Nei基因多样性(H)分别为0.80，0.41，0.46，均略高于白毛茶(图 6)。另外，将茶品种与白毛茶品种分为2个群体，根据Popgene的计算，60对EST-SSR标记在2个群体的F-统计量结果(表 2)可知: 60个标记中TM127，129，137，139等12个标记显示出杂合子剩余，种群内的近交系数F_is平均为0.21，说明群内近交现象较严重。另外，种群分化系数为-0.76 (TM186)~0.89 (TM149)，F_st平均为0.02，即有2%的变异来源于群体间，有98%的变异来源于群体内。

3 结论与讨论 3.1 广西茶树地方品种的遗传多样性

等位基因数是反映群体遗传多样性的指标之一，在保护遗传学研究中，尤其更强调等位基因数对研究种群遗传变异的影响。在茶树遗传研究中，其有效等位基因数有待进一步确定。Ohsako等(2008)采用6个微卫星标记对日本京都8个群体共146个地方品种的遗传多样性进行研究，检测到的等位基因数为3.83~4.67。Sharma等(2009)采用61对微卫星标记检测来自茶树及近缘种的34份种质资源，检测到的等位基因数为2~16，平均为5.31。Zhao等(2008)采用茶树及其变种共检测到等位基因数平均为4.46，而刘振等(2008; 2009)采用微卫星标记检测我国西南地区及福建茶树资源的平均等位基因数分别为4.74和3.30。本研究所采用的60个微卫星标记，平均等位基因为3.88，与上述的研究结果相近，说明本研究采用的EST-SSR标记对揭示广西茶树遗传多样性水平是可靠的。

另外，遗传杂合度是衡量群体内物种遗传变异的重要指标，其值高则遗传变异大，反之则变异小。而遗传变异的大小是衡量选择潜力的依据，变异大则选择潜力大，反之则选择潜力小。采用60个标记对广西51个茶树地方品种进行检测，发现其平均观测杂合度(H_o)为0.37，平均期望杂合度(H_e)为0.47，Shannon信息指数(I)平均为0.82，多态信息含量(PIC)平均为0.41。根据左志明等(1994)对桂西山区茶树种质资源考察发现，桂西山区各种类型的茶树种质资源非常丰富。本试验由于客观条件等原因，采用样品中包含桂西地方品种较少(尤其是野生资源)，对试验结果可能有一定影响。另外，本文主要针对广西茶树地方品种进行研究，研究发现各地区地方品种间的遗传多样性比较接近，这在一定程度上降低了整体的多态性水平。

3.2 广西不同地区茶树地方品种间的亲缘关系

基于Nei's (Nei，1973)遗传距离，利用PowerMarker 3.25软件进行NJ聚类分析，构建51份地方品种的无根树状聚类图。如图 1所示，全部品种聚为3类:桂林和来宾的大部分品种、钦州和梧州的全部品种聚在第Ⅰ类; 第Ⅱ类包含了多数地区的品种; 第Ⅲ类主要由崇左、防城港的品种组成。另外，基于模型的遗传结构分析表明，当K=3时，能够取得最大的lnP(D)值和比较稳定的α值，即广西茶树地方品种可分为3个类群(图 3) :类群A主要由桂林、钦州、贺州和梧州的品种组成; 类群B包含了多数地区的品种; 类群C包含了防城港、崇左和南宁的大部分品种。基于模型和遗传距离的分析结果基本一致，广西南部(崇左、防城港和南宁)和北部(桂林、钦州、梧州和来宾)的茶树地方品种分别聚在一类，即来自防城港、崇左和南宁的地方品种亲缘关系较近，来自桂林、钦州、贺州、来宾和梧州的品种亲缘关系较近。

3.3 茶与白毛茶的分化情况

一个自然群体由于各种原因往往会发生变异，形成各种亚群，亚群间的遗传差异就是亚群间的遗传分化。本研究采用F-统计量(F_it，F_st，F_is)，即总近交系数F_it、种群分化系数F_st、种群内的近交系数F_is来衡量遗传分化。F_is值变化在-1~1之间，值越小，杂合子越多; 值越大，纯合子越高; 值为0则说明群体是随机交配的。本研究采用的60个标记中只有TM127，129，137，139等12个标记表现出杂合子剩余，其余的位点表现杂合子缺失，说明茶与白毛茶群体间的近交现象比较严重，导致杂合子缺失。另外，种群分化系数F_st为0.02，即有2%的变异来源于群体间，有98%的变异来源于群体内。

根据张宏达(1981a; 1981b; 1984; 1990)、闵天禄(1992)和陈亮等(2000)对茶树系统分类的研究，白毛茶都是作为茶的一个变种，在表型方面二者表现出较高的相似性，其区别主要在于白毛茶花萼和嫩枝外部密被茸毛，叶片长多内折，叶面光滑，叶质较硬多革质。本研究结果表明，二者之间的遗传分化不显著，可能因为茶与白毛茶本身的相似度较高，本研究采用的样品量或标记量不足于揭示二者之间的差异，在今后的研究中应适当增加标记数量。另外，基于遗传距离和基于模型的聚类分析结果一致，均表明茶与白毛茶在不同类群中穿插分布现象严重，可能是由于地区间基因的频繁交流，导致遗传背景复杂。因此，白毛茶的分类归属问题值得进一步深入研究。

EST-SSR方法揭示了广西茶树地方品种遗传多样性较丰富，但各地区间(不包含桂西)的遗传相似性较高，区域差异对品种变异影响不显著，茶与白毛茶群体间的遗传分化较低。因此在今后的茶树选育过程中，在充分利用地方品种的同时，还应着重引入外源的遗传变异。