文冠果(Xanthoceras sorbifolia)为无患子科(Sapindaceae)文冠果属植物，落叶乔木或灌木，是我国特有的木本油料和药用植物，可生产柴油、食用油和高级润滑油。文冠果被列为“十五”期间国家重点生物燃油树种，种仁含油率为55%~67%(高伟星等，2007)，种仁含有的11种油脂肪酸的碳链长度主要集中在C₁₆~C₁₈之间，适合生产生物柴油(牟洪香等，2007)，文冠果食用油中的亚油酸是中药“益寿宁”的主要成分。为满足食用油业、生物柴油业及药物成分生产业对文冠果种子和苗木的需求，本课题组初步建立了文冠果体胚发生的培养体系(顾玉红等，2004)，研究发现Ca²⁺与文冠果体胚发生密切相关(顾玉红等，2008)。

体胚的形态建成由基因调控，而蛋白质是基因表达的产物。目前，已见关于玉米(Zea mays)(Franz et al., 1989)、水稻(Oryza sativa)(Wgiroix et al., 1996)、胡萝卜(Daucus carota)(Umeda et al., 1997；朱长甫等，1997)、檀香(Santalum album)(Anil et al., 2000)等植物体胚蛋白质组分的单向电泳图谱的研究，说明蛋白质组分与体胚形态建成密切相关。但有关体胚形态建成过程的6个发育时期蛋白质组分的双向电泳的研究国内尚未见报道。本研究以文冠果种胚离体培养诱导获得的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、球形胚、鱼雷胚、子叶胚、再生植株为材料，运用双向电泳技术，对文冠果体胚形态建成过程中各时期的蛋白质组分进行研究，旨在揭示其蛋白质组分的变化规律，寻找标记蛋白，为进一步纯化和富集与体胚发育相关的标记蛋白并克隆与其相关的基因、更好地调控文冠果体胚的发育奠定基础，进而为利用文冠果体胚发生体系进行快繁和品种改良服务，也为文冠果合子胚的形态建成的研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

文冠果的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、球形胚、鱼雷胚、子叶胚、再生植株。

1.2 方法 1.2.1 文冠果体胚的诱导方法

文冠果的成熟种胚在B₅+2, 4-D 1 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1+琼脂6 g·L^-1的培养基上诱导产生非胚性愈伤组织，在B₅ +2, 4-D 0.5 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1 +琼脂6 g·L^-1的培养基上继续培养获得胚性愈伤组织，在B₅+6-BA 1 mg·L^-1 +NAA 0.25 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1的培养基中，产生球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚，子叶胚在B₅+6-BA 0.5 mg·L^-1 +NAA 0. 5 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1的培养基中发育成有多片幼叶的再生植株。

1.2.2 蛋白质的提取和双向电泳

取保存在-80 ℃的材料1 g，加0.1 g PVP，液氮中研磨成粉末。将粉末转入装有蛋白提取A液(含10% TCA，0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液)的50 mL离心管中，摇匀，-20 ℃下放置2 h，期间摇晃1次。4 ℃下，12 000 r·min^-1离心30 min。弃上清液，倒入蛋白提取B液(含0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液)，用玻璃棒搅拌，-20 ℃下放置2 h，期间摇晃1次。4 ℃下，12 000 r·min^-1离心30 min。重复提取3次，直至蛋白质沉淀物为纯白色，-20 ℃冻干即可使用或在-20 ℃保存备用。准确称取0.03 g蛋白粉末放入1.5 mL离心管中，加入300 μL样品裂解液(含9 mol·L^-1尿素、4%CHAPS、2%Pharmalyte3-10，双蒸水定容)，36~37 ℃下水浴1 h。4 ℃下，14 000 r·min^-1离心15 min，取上清液，-80 ℃下保存备用。双向电泳所用的仪器是Amersham Bioseciences公司的系列电泳设备，大致步骤：第1向电泳(等电聚焦电泳)、平衡胶条、第2向电泳(SDS-PAGE)、银染法染色、用UMAX Powerlook 2100XL型凝胶扫描仪进行透射扫描(600 bpi，彩色)，然后用Photoshop 7.0软件结合肉眼观察进行相邻发育阶段的蛋白点比较分析(顾玉红，2005)，找出表达量明显增加的、减少的、新出现的、消失的蛋白点及各时期特有的标记蛋白质。重复2次。

2 结果与分析 2.1 文冠果体胚的诱导

文冠果种胚块在B₅+2, 4-D 1 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1 +琼脂6 g·L^-1的固体培养基上，切口处产生透明和淡黄色、质地柔软、易分散、表面光滑的非胚性愈伤组织(图 1-1)；非胚性愈伤组织在B₅+2, 4-D 0.5 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1+琼脂6 g·L^-1的固体培养基上，开始分化，发育成淡黄和黄色、质地柔软、易分散、表面不光滑的胚性愈伤组织(图 1-2)；胚性愈伤组织在B₅+6-BA 1 mg·L^-1+NAA 0.25 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1的液体培养基中，继续分化和分裂，依次产生表面光滑的球形胚(图 1-3)、具有2个子叶原基的心形胚、梭形的鱼雷胚(图 1-4)和具有2片子叶的子叶胚(图 1-5)；子叶胚在B₅+6-BA 0.5 mg·L^-1 +NAA 0.5 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1的培养基中发育成有多片幼叶的再生植株(图 1-6)。

2.2 文冠果体胚形态建成过程中的蛋白质组分

文冠果非胚性愈伤组织的蛋白质组分如图 1-7所示，蛋白质组分比其他发育时期都少，其中20.1 ku(pI3.1)的蛋白质和18.9 ku(pI3.1)的蛋白质在胚性愈伤组织中消失，在球形胚、鱼雷胚中又重新出现，且表达量很小，在子叶胚和再生植株中又消失；25.0 ku(pI8.8)的蛋白质和26.0 ku(pI8.8)的蛋白质，在胚性愈伤组织中表达量最大，球形胚时期减弱，鱼雷胚时期以后消失，可能与胚性的发生有关。

文冠果胚性愈伤组织的蛋白质组分如图 1-8所示，与非胚性愈伤组织相比，7种蛋白质即16.1 ku(pI4.2)，16.9 ku(pI4.3)，14.8 ku(pI4.5)，16.5 ku(pI4.6)，14.9 ku(pI5.0)，20.0 ku(pI5.7)，29.5 ku(pI7.0)的蛋白质表达量明显增大，15种蛋白质即16.3 ku(pI3.1)，16.5 ku(pI3.1)，16.8 ku(pI3.1)，17.3 ku(pI 3.1)，17.5 ku(pI3.1)，30.0 ku(pI3.1)，17.5 ku (pI 3.2)，37.5 ku(pI3.5)，37.5 ku(pI3.6)，37.6 ku(pI3.6)，33.3 ku(pI3.7)，34.0 ku(pI3.7)，41.7 ku(pI4.2)，14.5 ku(pI4.3)，17.3 ku(pI5.2)的蛋白质表达量明显减小，同时新出现了17种蛋白质，即55.0 ku(pI4.9)，63.6 ku(pI 4.9)，50.2 ku(pI5.2)，63.4 ku(pI 5.2)，62.2 ku(pI5.3)，50.2 ku(pI5.5)，53.0 ku(pI5.5)，17.7 ku(pI 6.8)，17.7 ku(pI6.9)，23.0 ku(pI6.9)，41.7 ku(pI8.0)，41.7 ku(pI8.2)，23.5 ku(pI8.5)，24.0 ku(pI8.5)，26.2 ku(pI8.5)，40.4 ku (pI8.7)，41.0 ku(pI8.9)的蛋白质，其中23.0 ku(pI6.9)的蛋白质为胚性愈伤组织所特有，是胚性愈伤组织的标记蛋白。

文冠果球形胚时期的蛋白质组分如图 1-9所示，与胚性愈伤组织相比，11种蛋白质即19.2 ku(pI6.1)，31.5 ku(pI7.3)，21.1 ku(pI8.5)，21.5 ku(pI8.7)，19.0 ku(pI9.3)，19.1 ku (pI9.3)，19.5 ku(pI9.3)，19.7 ku(pI9.5)，17.3 ku(pI9.6)，19.7 ku(pI9.6)，19.7 ku(pI9.7)的蛋白质表达量明显增大，4种蛋白质即16.8 ku(pI4.9)，17.3 ku(pI4.9)，23.1 ku(pI5.6)，24.0 ku(pI5.6)的蛋白质表达量明显减小，23.0 ku(pI6.9)的蛋白质消失，同时新出现了12种蛋白质，即18.9 ku(pI3.1)，20.1 ku(pI3.1)，16.3 ku(pI5.7)，32.6 ku(pI7.5)，40.4 ku(pI7.8)，32.0 ku(pI 8.2)，31.2 ku(pI8.4)，32.0 ku(pI8.7)，31.2 ku(pI8.8)，41.2 ku(pI9.0)，43.0 ku(pI9.3)，32.4 ku(pI9.6)的蛋白质。

文冠果鱼雷胚时期的蛋白质组分如图 1-10所示，与球形胚时期相比，19.2 ku(pI5.6)的蛋白质表达量明显增大，3种蛋白质即30.0 ku(pI5.5)，30.0 ku(pI7.4)，27.5 ku(pI7.5)的蛋白质表达量明显减小，3种蛋白质即26.3 ku(pI9.1)，26.0 ku(pI8.8)，25.0 ku(pI8.8)的蛋白质消失，同时新出现了10种蛋白质，即29.0 ku(pI4.3)，17.3 ku(pI4.4)，19.0 ku(pI4.5)，25.1 ku(pI4.5)，27.0 ku(pI4.5)，28.0 ku(pI4.5)，16.7 ku(pI4.6)，32.0 ku(pI4.7)，41.7 ku(pI5.0)，27.1 ku(pI7.5)的蛋白质，其中27.1 ku(pI7.5)的蛋白质为鱼雷胚时期所特有，是鱼雷胚时期的标记蛋白。

文冠果子叶胚时期的蛋白质组分如图 1-11所示，与鱼雷胚时期相比，3种蛋白质即24.1 ku(pI5.2)，18.5 ku(pI6.1)，25.2 ku(pI9.0)的蛋白质表达量明显增大，2种蛋白质即20.1 ku(pI4.6)，19.2 ku(pI6.0)的蛋白质表达量明显减小，5种蛋白质即18.9 ku(pI3.1)，20.1 ku(pI3.1)，17.3 ku(pI6.7)，16.9 ku(pI6.9)，27.1 ku(pI7.5)的蛋白质消失，同时新出现了14种蛋白质，即31.0 ku(pI3.2)，24.5 ku(pI3.5)，30.0 ku(pI3.8)，17.7 ku(pI 4.0)，15.3 ku(pI4.1)，25.1 ku(pI6.6)，26.2 ku(pI6.6)，19.3 ku(pI6.7)，20.1 ku(pI6.7)，26.5 ku(pI7.3)，31.0 ku(pI7.7)，31.5 ku(pI8.6)，32.6 ku(pI8.9)，23.0 ku(pI9.0)的蛋白质，其中25.1 ku(pI6.6)和26.2 ku(pI6.6)的蛋白质为子叶胚时期所特有，是子叶胚时期的标记蛋白。

文冠果再生植株时期的蛋白质组分如图 1-12所示，与子叶胚时期相比，6种蛋白质即56.0 ku(pI5.3)，56.0 ku(pI5.4)，55.1 ku(pI5.5)，56.2 ku(pI5.5)，55.0 ku(pI6.7)，55.0 ku(pI6.9)的蛋白质表达量明显增大，5种蛋白质即30.0 ku(pI3.2)，21.0 ku(pI5.4)，20.1 ku(pI9.4)，20.1 ku(pI9.6)，20.1 ku(pI9.7)的蛋白质表达量明显减小，6种蛋白质即20.1 ku(pI6.6)，19.3 ku(pI6.9)，18.1 ku(pI7.2)，21.0 ku(pI 7.5)，31.0 ku(pI7.7)，20.1 ku(pI9.8)的蛋白质消失，新出现了1种23.2ku(pI9.5)的蛋白质，它为再生植株时期所特有，是再生植株的标记蛋白。

3 结论与讨论

蛋白质是基因表达的直接产物，在一定程度上反映了基因的表达情况，与细胞的分化、植物的形态建成密切相关。通过比较相邻发育阶段的双向电泳图谱，表明文冠果体胚形态建成过程中，绝大多数蛋白点在各发育阶段均有表达，重叠度高，而且非胚性愈伤组织的蛋白质组分最少，随着体胚形态建成的进行而逐渐增多，到了再生植株时期蛋白质组分减少，整个发育过程中伴随着部分蛋白质表达量的增加或蛋白质组分的减少，还有标记蛋白的表达。推测非胚性愈伤组织处于未分化状态，表达的多是维持细胞生命的管家基因和调节基因，与形态建成相关的组织特异性基因尚未表达，因而此时期蛋白质组分最少；在胚性愈伤组织时期，与胚性产生有关的基因开始表达，细胞开始分化；在球形胚时期，细胞继续分化并导致体胚呈球形；球形胚经过心形胚发育成鱼雷胚、子叶胚、再生植株，体胚的维管束、胚根、胚芽、子叶等组织器官的形态建成明显，大量的组织特异性基因开始表达，这3个时期分别伴随着10种、14种、1种蛋白质的出现和3种、2种、6种蛋白质消失的现象，充分反映了在体胚形态建成过程中部分基因开启的同时伴随部分基因的关闭。

本研究发现23.0 ku(pI6.9)的蛋白质、27.1 ku(pI7.5)的蛋白质、25.1 ku(pI6.6)和26.2 ku(pI6.6)的蛋白质、23.2 ku(pI9.5)的蛋白质分别为胚性愈伤组织、鱼雷胚、子叶胚及再生植株所特有，可分别作为以上各时期的标记蛋白。Wgiroix等(1996)研究发现59 ku蛋白质存在于水稻体胚的球形胚中，56 ku蛋白质存在于早期成熟胚中，32 ku蛋白质出现在晚期成熟胚中；Tan等(2000)发现44 ku的蛋白质是胡萝卜体胚发生能力获得的标志；Tchorbadhieve等(2000)在鸭茅(Dactylis glomerata)中发现36 ku的蛋白质是胚性愈伤组织发生的标志。可见不同的物种和不同的发育时期，所特有的标记蛋白也不相同，这也是物种多样性的一种表现。本研究下一步的工作是对标记蛋白进行分离测序，进行结构和功能的分析，为在分子水平上阐明文冠果体胚形态建成的机制奠定基础。