松果梢斑螟(Dioryctria pryeri)是我国松属(Pinus)针叶树重要害虫之一, 该虫属寡食性害虫, 在我国北方主要危害油松(Pinus taebulaeformis) (李宽胜, 1992；李新岗，2002)。此虫1年1代, 以2龄幼虫越冬, 幼虫在5—6月份钻蛀球果及新梢, 致使嫩梢枯萎, 球果干瘪, 影响油松的正常生长发育和种子生产(袁荣兰等，1990；姚远等，1996), 特别是结实期的油松种子园、母树林受害最为严重。松果梢斑螟可与油松球果小卷蛾(Gravitarmata margarotana)一起危害油松球果, 在油松良种基地造成巨大的产量损失(李新岗等，2006；2007)。

植物挥发物在植食性昆虫的寄主选择和产卵选择中起着重要作用(杜家纬，2001)。针叶树挥发物主要是单萜和倍半萜成分, 针叶树害虫则借助这些挥发物成分(或称化学信号)确定其寄主和产卵位点(Ahman et al., 1988；Leather, 1987；Ross et al., 1995)，特别是单萜及其混合组分对有些梢斑螟成虫有很强的引诱作用(Fatzinger et al., 1985；Hanula et al., 1985；Shu et al., 1997；Kleinhentz et al., 1999)。机械损伤、病害和虫害都可以诱导针叶树特异性萜类挥发物的增加, 而梢斑螟成虫的趋向则与这些特异性挥发物密切相关(Herve et al., 1996; Valterova et al., 1995; Kleinhentz et al., 1999; Jactel et al., 1994)。笔者前期研究表明：油松球果小卷蛾的先期危害, 引起松果梢斑螟的聚集和严重危害, 表现为松果梢斑螟幼虫趋向小卷蛾危害球果取食, 而其成虫则趋向受害球果产卵(李新岗等，2006；2007；2009)。为了探讨松果梢斑螟成虫产卵期, 油松虫害球果引诱松果梢斑螟的特异性成分, 本文比较了油松虫害球果和健康球果挥发物的差异, 研究了松果梢斑螟成虫对主要单萜挥发物及其不同组合的触角电位(electroantennogram, EAG)反应, 为控制其危害提供科学理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

7月上旬, 在陕西省洛南县古城林场采集被害的油松球果, 带回实验室放置在0.8 m×0.8 m ×1.0 m的网笼内, 每天8:00—10:00检查松果梢斑螟成虫羽化情况, 对羽化成虫单头装入养虫杯(直径8.0 cm, 高9.0 cm)内, 用10%的蜂蜜水补充营养, 并放入湿棉球, 保持湿度。实验室温度控制在(28±1)℃, 光周期为16L:8D, 相对湿度60%~70%, 每天更换1次蜂蜜水和湿棉球。将当天羽化的雌雄成虫转入养虫笼内交配。48 h后分别放回养虫杯内, 作为测试昆虫。而未交配的雌雄成虫, 待发育到3日龄作为测试昆虫。

1.2 供试标准化合物

根据油松球果顶空吸附的结果以及梢斑螟成虫趋向和产卵选择的化合物及其组合试验结果(李新岗等，2009)，结合本研究的结果(表 3)，确定梢斑螟触角电位所用标准化合物共6种(表 1)。再根据表 4的测试结果，确定不同组合的化合物共4种(表 2)。各标准品化合物均用1 mL石蜡油(paraffin)作溶剂配制而成, 浓度梯度为10.0，1.0，0.1，0.01和0.001 mg·mL^-1, 测定松果梢斑螟不同成虫类型对不同浓度标准化合物的EAG反应。

1.3 触角电位仪

电极：Syntech金属电极；刺激放大器：Syntech CS-55；直流/交流放大器:SyntechUN-06；微动操作仪：Syntech MP-15；分析软件：Syntech软件；连续气体流量：124 mL·min^-1；刺激气体流量：20 mL·min^-1。

1.4 油松球果挥发物的提取与鉴定

选取油松健康球果和受害球果各100g(约4~5枚球果), 分别放入2个500 mL的广口瓶内, 用封口膜封口后, 置于45 ℃的水浴锅内(王明林等，2006), 将固相微萃取(solid phase microextraction, SPME)装置(DVB/CAR/PDMS)的针头穿透封口膜, 插入瓶内球果上方, 然后小心地推出纤维头, 同时用固定装置固定固相微萃取装置的手柄, 自萃取纤维头推出后开始计时，吸附45 min，立即进行分析。

挥发物的鉴定利用美国Thermo-Finnigan公司的TraceDSQ气相色谱-质谱仪(GC-MS)(西北农林科技大学测试中心)分析, 色谱柱利用SE-54毛细管柱(30 m×0.25 mm ID, 膜厚0.25 μm), 载气氦气；流速1 mL·min^-1, 进样1 μL, 分流比50:1。起始温度40 ℃, 停留2.5 min, 以8 ℃·min^-1升到250 ℃(李新岗等, 2006；2007)。质谱条件:EI离子源, 电离能70 eV。各成分通过与谱库(NIST2002版)标准化合物的质谱图核对并分析后, 进行定性, 根据峰面积归一化法进行定量。

1.5 触角电位反应测试

1) 梢斑螟触角电位反应测试  取羽化的雌、雄成虫, 将触角从基部剪下, 去除顶端1节, 用导电胶将其粘在电极上, 然后把电极与微操作台相连接后, 以气味源的气流刺激触角, 观察放电信号, 通过微机记录信号并进行处理，取刺激开始后3~4 s的电信号作为EAG反应信号。在25~28 ℃条件下测定触角电位反应(方宇凌等，2002)。

2) 松果梢斑螟对萜类标准品的EAG反应  不同剂量标准品的EAG反应触角电生理测定参照方宇凌等(2002)的方法。

EAG反应值的大小是通过测量EAG波形向下的峰值幅度来获得的。先将测试样品配成石蜡油溶液, 每次吸取25 μL的溶液均匀地滴在滴管中的滤纸片(6.0 cm×0.5 cm)上, 滴管末端连接刺激气体控制装置, 每次刺激时间0.1 s，每2次刺激时间间隔为30 s以上。每种待测样品共选用待测成虫10头, 每个触角重复3次。

在整个测定过程中, 触角的反应会减弱, 且不同触角存在着个体差异。为此, 笔者以标准化合物1R-(+)-α-蒎烯(100 μg·μL^-1)EAG值为参比；同时, 为了消除空气、溶剂造成的影响, 将等量的石蜡油直接滴在滤纸上, 以此样品为对照。在待测样品和标准化合物测定前后, 各做1次对照。这样, 将样品EAG测量值减去前后对照的平均值, 得到样品EAG反应的绝对值。参比值减去前后所测的对照平均值, 得到参比样品反应的标准值, 将样品反应的绝对值除以参比样品反应的标准值, 就得到了样品反应的相对值(方宇凌等，2002；赵成华等，1995；郝德君等，2006)。

萜类混合组分的EAG反应测定用1 mL石蜡油(paraffin)作溶剂, 各标准品的用量根据虫害球果中含量和标准品的挥发量确定, 并且各种组合中某一标准品的用量都一样, 如表 2所示。

2 结果与分析 2.1 油松健康球果与受害球果挥发物组分比较

表 3列出7月份油松健康球果和虫害球果挥发性萜类化合物的比较。可以看出：虫害球果共检出挥发性成分19种, 健康球果共检出挥发性成分14种, 主要是单萜、倍半萜类及其衍生物(选择相对含量大于0.1%的组分进行比较)。2类球果的单萜挥发物主要为α-蒎烯、β-蒎烯、β-香叶烯、D-柠檬烯、3-蒈烯、莰烯、异油松烯等组分, 倍半萜主要为大香叶烯、石竹烯和3, 3-杜松二烯等组分。比较结果发现：油松球果受害后所释放的挥发物组分和含量与健康油松球果相差很大, 其中虫害后α-蒎烯、D-柠檬烯、τ-萜品烯、异油松烯及乙酸龙脑脂的相对含量增加；β-蒎烯、4-侧柏烯和石竹烯的相对含量减少；而三环萜、莰烯、β-水芹烯、萜品烯、4-杜松烯的变化不明显；虫害后新增加的组分有3-蒈烯、大香叶烯、M-伞花烯、3, 3-杜松二烯和L-葑酮。

2.2 松果梢斑螟对6种不同浓度萜类组分的EAG反应

表 4比较了松果梢斑螟成虫对6种不同浓度萜类组分的EAG反应值。随着各萜类浓度的增加, EAG值有增大的趋势；并且雄蛾的EAG值最高, 已交配雌蛾最低, 未交配雌蛾介于二者之间。就交配雌蛾和未交配雌蛾的EAG反应来看, 只有α-蒎烯达到一定浓度(分别在0.1和1.0 μg·μL^-1)时EAG值为最大, 随后EAG值下降；其他5种萜类组分都随浓度的增加EAG值不断增加, 其中β-香叶烯和D-柠檬烯随浓度变化增加的最为显著, 石竹烯增加的最不明显。雄蛾对6种挥发物不同浓度的EAG反应来看, 随着浓度的增加EAG值增加显著, 其中β-香叶烯、D-柠檬烯和萜品油烯增加的最为显著, 石竹烯增加的最不显著。

2.3 松果梢斑螟对混合组分的EAG反应

松果梢斑螟雌、雄蛾对不同混合组分样品的EAG反应列于表 5。从表中可以看出：α-蒎烯+β-香叶烯+D-柠檬烯和α-蒎烯+β-蒎烯+β-香叶烯+D-柠檬烯混合组分样品都能引起梢斑螟交配雌蛾最大的EAG反应, 其次是α-蒎烯+β-蒎烯+β-香叶烯、α-蒎烯+β-香叶烯和α-蒎烯+D-柠檬烯混合组分样品。梢斑螟已交配雌蛾对各混合组分样品的EAG反应均高于未交配雌蛾和雄蛾, 这与梢斑螟交配雌蛾正处在产卵敏感期有关。各混合组分样品的EAG反应值比较发现：β-蒎烯在组合中可能起抑制作用, α-蒎烯在组合中具有重要的基础作用, β-香叶烯和D-柠檬烯可能起增效作用。梢斑螟已交配雌蛾对α-蒎烯+β-香叶烯+D-柠檬烯混合组分样品的EAG反应最强烈, 与笔者行为测试的结果一致(李新岗等，2009)，应为最佳组合。

3 讨论

固相微萃取法(SPME)和GC-MS分析发现:虫害球果与健康球果相比, 虫害球果所释放的挥发物组分和含量发生了较大的变化, 其中变化比较明显的组分有α-蒎烯、β-蒎烯、β-香叶烯、D-柠檬烯、3-蒈烯和石竹烯。而李新岗等(2007；2009)采用顶空吸附法与GC-MS研究认为, 2年生油松球果虫害后的特异性组分是α-蒎烯、β-香叶烯和D-柠檬烯。

选择6种存在于油松球果挥发物中的萜类组分和5个浓度(10.00，1.00，0.10，0.01和0.001 μg·μL^-1)梯度, 对3种生理状态的梢斑螟成虫EAG测试显示：随着各萜类浓度的增加, EAG值均有增大的趋势；并且雄蛾的EAG值增加的最明显, 已交配雌蛾最低, 未交配雌蛾介于二者之间。交配雌蛾和未交配雌蛾的EAG反应来看, 只有α-蒎烯分别在0.1和1.0 μg·μL^-1时EAG值达到最大, 随后EAG值下降；其他5种萜类组分都随浓度的增加EAG值不断增加, 其中β-香叶烯和D-柠檬烯随浓度增加的最为显著，倍半萜石竹烯增加的最不明显；雄蛾随浓度增加, β-香叶烯、D-柠檬烯和萜品油烯的EAG值增加的最为显著, 石竹烯增加的最不显著。混合组分的EAG值测试发现：α-蒎烯+β-香叶烯+D-柠檬烯混合组分的EAG反应最强烈, 与笔者行为测试结果一致(李新岗等, 2009), 应为最佳组合。其中β-蒎烯在组合中可能起抑制作用, α-蒎烯在组合中具有重要的基础作用, β-香叶烯和D-柠檬烯可能起增效作用。

美国南方松梢斑螟(Dioryctria amatella)成虫明显趋向庖锈病(Cronartium strobilinum)危害的2年生球果产卵, 寄主引诱成分为α-蒎烯、香叶烯和柠檬烯(Hanula et al., 1985；Shu et al., 1997)；白松梢斑螟(D. abietivorella)的引诱成分为香叶烯、Δ³-长松针烯和(-)-柠檬烯, 其中前2种单萜成分可以刺激最显著的EAG反应(Shu et al., 1997；Miller et al., 2003)；机械损伤的海岸松(Pinus pinaster)容易引起赤松梢斑螟(D. sylvestrella)的蛀干危害, 寄主引诱成分为莰烯、异松油烯, 以及损伤后特异组分—单萜氧化物芳樟醇(Kleinhentz et al., 1999)。笔者的研究表明：松果梢斑螟成虫寄主引诱成分为3种挥发性单萜组分，与行为测试的结果一致(李新岗等, 2009)。但是，松果梢斑螟成虫寄主引诱组分与产卵刺激组分是否一致, 以及引诱组分在林间的引诱效果，还需要进一步的研究。