山核桃(Carya cathayensis)是世界著名的干果之一，也是重要的木本油料作物，其油味清香、营养丰富，是优良的休闲保健食品。山核桃长期以来产量不稳、大小年现象明显，通过肥水管理、病虫害防治等有效管理措施，大部分产区大小年现象都明显趋缓，产量逐年上升(黎章矩，2003)。我国山核桃研究起步较晚，在其营养方面的研究甚少。有很多山核桃林农在经济利益的驱使下盲目施肥，特别是氮肥，导致很多山核桃林地出现施肥过量现象，这不仅降低肥料的利用效率，而且造成资源的浪费，引发严重的污染。因此，寻求简便、快速、无破坏地检测山核桃的生长状况，进而指导山核桃施肥和种植管理十分必要。

氮素是对植物生长、产量和品质影响最为显著的营养元素。氮素的丰缺可以通过叶绿素的含量和组成间接反映出来，利用反射光谱数据来估测植物叶绿素含量和氮素状况进而监测植物的长势，已成为实时定量施肥的一种重要监测手段(孙雪梅等，2005；陈维君等，2006；唐延林等，2004；张雪红等，2007)。研究人员不断用水稻(Oryza) (唐延林等，2004)、小麦(Triticum aestivum) (李映雪等，2006)、玉米(Zea mays) (王磊等，2005)等作为研究材料，确定叶片水平氮素含量遥感估算的敏感波段和光谱指数；但即使同一作物的研究也会出现相互矛盾的结果，如Kokaly等(2001)研究表明：利用2 054和2 172 nm的光谱吸收特征可以估算水稻叶片的氮素含量，但唐延林等(2004)研究发现：红边位置与水稻叶绿素、类胡萝卜素含量间存在极显著相关，可用来估算水稻冠层和叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量。利用反射光谱技术分析植物营养状况的研究主要集中在作物方面，在木本植物上的研究与应用还很少；而木本植物的生理代谢与草本植物并不完全相同，根系生长和需肥情况也与农作物有明显的不同(Laclau et al., 2009)，因此开展木本植物的光谱诊断机制研究具有重要的意义。针对山核桃盲目大量施氮肥的问题，本文利用反射光谱技术探讨不同氮素浓度处理之间山核桃反射光谱特征差异，通过分析山核桃反射光谱及其相关参数对不同氮素浓度的响应特征，提出快速、准确、无损伤的分析山核桃氮素营养状况方法，对山核桃的施肥具有重要的实践指导意义。

1 材料与方法 1.1 试验材料

生长基本一致的2年生山核桃实生苗(平均苗高80.0 cm，平均地径6.5 mm)，由临安山核桃省级区域科技创新服务中心提供。

1.2 试验方法

1) 试验设计  溶液培养试验于2009年4—11月在浙江农林大学人工智能气候室内进行。光强为自然光, 温度为30 ℃/25 ℃(昼/夜)，光周期为自然光周期，湿度为(70±5)%。于2009年4月初将筛选的20株山核桃根系用清水清洗干净(尽量不损伤根系)，移栽至装有12.5 L完全营养液的塑料桶中培养。营养液按照霍格兰营养液作一定调整后配制。配方如下：1.25 mmol·L^-1 Ca(NO₃)₂, 0.5 mmol·L^-1 Ca(H₂PO₄)₂, 1.0 mmol·L^-1K₂SO₄, 0.5 mmol·L^-1MgSO₄, 1.0 μmol·L^-1MnSO₄, 12.5 μmol·L^-1H₃BO₃, 1.0 μmol·L^-1ZnSO₄, 0.25 μmol·L^-1CuSO₄, 0.1 μmol·L^-1 (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 10 μmol·L^-1 EDTA-Fe。pH调至5.7，24 h通气，隔天调节pH值，营养液每20天更换一次。预培养1个月后，按照以下处理继续培养，试验设4个氮素处理水平：0(对照)，0.5，1.5, 2.5 mmol·L^-1处理，每种处理设置5个重复，缺少的氮是去除培养液中的Ca(NO₃)₂·4H₂O和(NH₄)₆Mo₇O₂₄，分别用等浓度的CaCl₂和Na₆Mo₇O₂₄代替，于60天后进行光谱测定，测定的叶片为第3片完全展开叶(自上而下)，测定后取相同的叶片用于测定其他指标。

2) 光谱测定与计算  测量仪器为英国PP System公司的UniSpec-SC型便携式光谱分析仪，测定波长为310~1 130 nm，分辨率 < 10 nm，采样间隔1 nm。测定时，将1个分支光纤的一端连接到卤素灯的输出端口，另一端连接到检测器的输入端口，光纤的探头端固定在1个标准叶夹中。光谱反射率经过专用的白色参比板标准化。测定的时间为早上09:00—11:00，在每株苗木上选取由上而下第3个叶位的2片叶子，共测定10片叶子，即每个处理重复10次，取其平均值。

根据试验所测得的光谱数据，根据R′(λ_i)=(R_λi+1-R_λi-1)/(λ_i+1-λ_i-1)计算一阶导数，其中R′为反射光谱的一阶导数光谱，R为反射率，λ为波长，i为光谱通道。根据一阶导数光谱计算红边位置λ_red、红边幅值D_λred和红边面积S_red。红边位置λ_red是红光范围(680~760 nm)内一阶导数光谱最大值所对应的波长；红边幅值D_λred为红光范围(680~ 760 nm)内一阶导数光谱的最大值；红边面积S_red指680~760 nm之间的一阶导数光谱所包围的面积。同时根据试验所测得的光谱数据，直接利用相关公式计算得出反射光谱的相关参数值，所选指数列于表 1。

3) 叶绿素和类胡萝卜素的测定  将0.2 g叶片剪细，置于带盖的试管中，加80%丙酮10 mL，室温下遮光萃取至样品完全发白，分别测定470, 663, 645 nm的OD值，然后按Huang等(2004)方法计算叶绿素和类胡萝卜含量。

4) 叶片全氮的测定  把叶片带回实验室在105 ℃杀青30 min后，再于80 ℃下烘至恒质量，测定叶片干质量后，用浓硫酸混合催化剂消化后，利用凯氏定氮法(鲍士旦，2000)测定叶片全氮浓度。

5) 数据处理  在Excel里面通过相关公式将原始光谱数据进行相关计算，再利用SPSS13.0进行相关性分析。

2 结果与分析 2.1 不同氮素浓度处理对叶片色素含量和氮素含量的影响

氮素浓度的变化会影响植物叶绿素含量，从而影响光合作用。由试验的结果可知:随着氮素浓度的增加，山核桃叶片含氮量显著增加(P < 0.05)，缺氮情况下的叶片全氮含量只有氮素浓度2.5 mmol·L^-1时候的50%左右(图 1)；随着氮素浓度的增加叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量也显著增加(P < 0.05)，缺氮处理下，叶绿素b的含量是氮素浓度为2.5 mmol·L^-1的46%，类胡萝卜素的含量是氮素浓度为2.5 mmol·L^-1的39%，叶绿素a/b随着氮素浓度的降低明显上升(P < 0.05)，0.5 mmol·L^-1氮素浓度下达最大，随后又略有下降。而类胡萝卜素/叶绿素随着氮素浓度的降低则明显下降(表 2)。

2.2 不同氮素浓度处理下叶片反射光谱特征

从图 2可以看出：4种不同氮素浓度处理的山核桃叶片光谱反射率曲线的整体变化趋势一致，但是不同氮素浓度处理间反射光谱的反射率的大小是有差异的。各氮素浓度处理下，反射光谱存在最明显差异的是绿光区(525~605 nm)，其次是黄光区(605~655 nm)和短波近红外区(750~1 100 nm)。在可见光区山核桃的反射率随着氮素浓度的增加而减少，在波长550 nm下，缺氮处理的山核桃叶片反射率达到0.128；氮素浓度2.5 mmol·L^-1时反射率则为0.099，比缺氮处理下降23%。而在近红外区反射率随着氮素浓度的增加而增加，其中缺氮处理下反射率明显下降，而其他3个氮浓度处理下发射率差异不明显。

2.3 不同氮素浓度处理下叶片反射光谱的红边特征

在实际分析处理光谱数据的过程中，有时为剔除背景的影响和提高不同吸收特征的对比度，常常需要对原始高光谱数据进行微分变换，把试验所测得的光谱数据求一阶导数(图 3A)。红边是绿色植物光谱最明显的特征之一, 它是指绿色植物反射光谱位于红光范围(680~ 760 nm)这一段的光谱(图 3B)。4种不同氮素浓度处理的山核桃叶片在680~760 nm波段内都只有1个峰值。随着氮素浓度的增加，红边位置向长波方向移动(图 4A)，红边位置分别在708, 710，713，715 nm，而红边幅值和红边面积随着氮素浓度的增加呈现出先增大后减小的趋势(图 4B，C)，红边面积在氮素浓度0.5~1.5 mmol·L^-1区间形成峰值。

2.4 不同氮素浓度处理对光谱参数的影响

光谱参数是指绿色植物的光谱反射特征, 是反映植物生长状况的一组最常用的光谱变量。各光谱参数计算如表 3所示。结果表明：GNDVI，mSR705随着氮素浓度的增加而显著增加(P < 0.05)，SIPI, NPCI，mND705，R800/R700, (R678-R486)/R800也基本随氮素浓度的增加而增加，但在氮素浓度为2.5和1.5 mmol·L^-1下，SIPI, NPCI，mND705，R800/R700，(R678-R486)/R800变化不明显，在氮素浓度为0.5和0 mmol·L^-1下，SIPI, NPCI，mND705，(R678-R486)/R800变化不明显。NVDI, PSSRa，PSSRb，PRI，PSSRc，PSNDc随着氮素浓度的增加呈现出先增加后减小的趋势。而PSNDa，PSNDb，R800/R640，R800(1/R520-1/R700)只在缺氮情况下略有下降，其他氮素浓度下均无明显的变化(P>0.05)。

2.5 反射光谱参数与色素含量、叶片全氮的相关性分析

由表 4可以看出：山核桃叶片光谱参数PSSRb，PSSRc，PSNDa，PSNDc和叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、叶绿素a/b、类胡萝卜素/叶绿素、叶片全氮含量之间相关性都很小，均没有达到显著水平(P>0.05)。而GNDVI, Rch，NPCI，SIPI，R800/R700，λ_red与所有色素指标和全氮之间的相关性均达到显著(P < 0.05)或极显著水平(P < 0.01)。NVDI, PSSRa只与叶绿素a/b的相关性达到显著水平(P < 0.05)。PSNDb, R800/R640只与叶绿素a、类胡萝卜素/叶绿素之间的相关性达到显著水平(P < 0.05)。PRI, mSR705，mND705与类胡萝卜素含量的相关性没有达到显著水平，和其他参数之间均有显著或极显著的相关性。(R678-R486)/R800与除了叶绿素a之外的所有指标均达到显著相关性(P < 0.05)，而R800(1/R520-1/R700)只有与叶绿素a之间的相关性达到显著水平(P < 0.05)。

3 结论与讨论 3.1 山核桃氮素营养诊断的敏感波段

由于不同植物叶片之间以及同一植物不同部位的叶片之间色素含量(主要是叶绿素含量)的差异，它们之间的光谱曲线也是存在差异的(Gamon et al., 1999)。这是因为影响叶片光谱特性的主导控制因素一致，但不同的植物类别，因叶片色素含量、细胞结构、含水量等的差异而使光谱曲线总存在着一定的差异和变化，这些差异和变化正是对植物营养成分和长势等做出评估的依据(Sims et al., 2002)。张金恒等(2004)提出：水稻叶片氮素营养的光谱敏感波段为750~1 100 nm, 605~655 nm和525~605 nm。本试验在温室利用溶液培养法培养2年生山核桃幼苗，该方法可以很好地人为控制氮素浓度，发现不同氮素浓度处理之后山核桃叶片在525~605 nm波段反射率差异特别明显。该可见光波段主要反映植物叶片色素状况的，主要与叶片叶绿素含量相关(Gitelson et al., 1996b)，正是由于叶绿素对可见光的有效吸收，在该波段的光谱反射率随着植株缺氮状况而增强。而叶绿素与植株的全氮含量有显著的相关关系(Wolf et al., 1988)，故可以利用这个敏感波段光谱来快速诊断山核桃的氮素营养状况，从而初步评估山核桃的生长情况。

3.2 可用于山核桃氮素营养诊断的光谱指数

为了提高氮素营养状况的光谱诊断精度，笔者利用不同波段线性组合或比值计算不同的光谱指数。植物叶片的光谱指数主要和色素含量有关(Gitelson et al., 1996b)，目前国内外最常用于监测作物长势、估算植被叶面积指数、生物量和光合效率的指标(唐延林等，2004；Cater 1998；Mascarini et al., 2006)。基于植物的光谱指数来进行营养诊断是植物光谱诊断主要方法之一(Gupta et al., 2001)。Bronson等(2003)研究发现GNDVI与叶片氮积累量相关性比较好, 而张金恒等(2003)发现NDVl，RVI与水稻叶片含氮量的密切相关。Sims等(2002)提出的mSR₇₀₅和mND₇₀₅能够减小表面反射差异引起的影响，可以准确预测不同植被类型的叶绿素含量。在本研究中发现GNDVI，Rch，mSR705，mND705，R800/R700，λ_red无论是在低叶绿素含量还是中高含量下，都与叶绿素含量表现出极显著的相关，同时也与叶片氮素含量表现出显著的相关性(表 4)，而叶片氮素含量不同又是由于不同氮素浓度处理引起的(图 1)，表明这几个光谱指数在不同氮素浓度处理时，对叶片色素和氮素含量都有良好的估测效果，因此，这些参数对指导山核桃的施肥有实际的参考价值。

3.3 随着氮素浓度的增加山核桃红边出现“红移”现象

随着氮素浓度的增加山核桃幼苗的反射率在可见光波段逐渐变小，在近红外波段却基本呈相反趋势，这一结果与先前的大多数研究结果相吻合(张雪红等，2007；任红艳等，2005)。这是因为在可见光区域影响光谱反射的主导因子是叶绿素和类胡萝卜素(Sims et al., 2002)，叶绿素在可见光区有很强的光吸收能力，故随着氮素浓度的增加反射率反而减小；而在近红外区的反射率主要受细胞内部结构的支配作用(Sims et al., 2002)，不同氮素浓度处理后山核桃叶片的细胞内部结构发生变化，导致在近红外区表现出较高的反射率。随着氮素浓度的增加红边位置向长波方向移动，即“红移”现象，这是因为氮素是叶绿素的组成成分，氮素浓度高低可以导致叶片含氮量的不同，氮素浓度高的叶片对应的氮素含量也高，其新陈代谢能力也更强(Laclau et al., 2009)，故不同氮素处理的山核桃出现了“红移”现象。

3.4 不同氮浓度处理启动山核桃的叶黄素循环

当植物遇到其他环境胁迫，如高温、低温、干旱、盐胁迫或营养缺乏等条件时，更容易引起过剩激发能的产生，如果过剩的激发能不能被及时耗散，就会对光合机构造成不可逆的伤害(Muller et al., 2001)。对于过剩的激发能，植物主要是通过叶黄素循环进行热耗散(Muller et al., 2001; Kulheim et al., 2002)。PRI为反映叶黄素循环脱环化色素相对含量的指标(Gamon et al., 1999)，较高的PRI表明通过叶黄素循环耗散过剩激发能。而本文发现PRI与类胡萝卜素相关性不显著，但与Car/Chl比值的相关性达到极显著水平。这就表明在避免过剩激发能对光合系统的破坏过程中，Car/Chl可能比类胡萝卜素含量更加重要。本文中PRI先随氮素浓度上升后下降，在1.5 mmol·L^-1氮素浓度下达到最大值，表明在该浓度下叶黄素循环活力最强，最能有效的保护光合机构。这就表明氮素浓度过高或过低都不能有效的保护光合机构，1.5 mmol·L^-1氮素浓度对2年生山核桃的生长就已足够，超过该浓度对山核桃的生长并没有好处，这对指导后续的施肥具有十分重要的实践意义。