松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是一种特大毁灭性的森林病害, 在日本、美国、墨西哥、加拿大、韩国和葡萄牙发生、流行已经历了漫长的时间(Bergdahl, 1999)。我国自1982年在南京中山陵发现以来，据2008年底统计，该病在大陆14省的192个县发病面积已超过33.3万hm²，累计枯死松树5亿余株，经济损失上千亿元, 对我国松林资源、自然景观和生态环境造成了严重的破坏。该病在亚洲各国主要借助媒介昆虫松褐天牛(Monochamus alternatus)成虫传播(Yang, 2004)；在北美的美国、加拿大、墨西哥主要借助卡罗天牛(M. carolinensis)成虫传播, 在有其适宜生长繁殖的气候条件和树种的地方造成危害。东南部主要为害欧洲赤松(Pinus sylvestris)，当地松种因抗性而未造成流行性危害(Jack, 2008)；在日本自1905年发现此病以来, 曾在全日本大范围流行, 给日本黑松(P. thunbergii)和日本赤松(P.densiflora)带来了毁灭性灾害；我国自发现后, 在近20年时间里迅速扩散蔓延的形势很严峻，主要为害松种正由黑松、赤松向原以为有抗性的马尾松(P.massoniana)蔓延，林间感病死亡的松树中马尾松所占的比例已由20世纪80年代的10%增加到现在的50%以上。马尾松是我国南方19省区的主要乡土松种, 有数千万公顷, 横跨热带亚热带地区, 该区域森林群落复杂, 资源丰富；江苏省苏南太湖风景区、宜溧山区(以马尾松、黑松为主)及已逼近的黄山风景区，一旦松材线虫病在上述区域内流行成灾, 将造成无法估量和不可挽回的损失(徐福元，1998)。因此，有必要评价和明确马尾松和马尾松种源对松材线虫病、松褐天牛的抗性及其机制，为松材线虫病的综合、协调治理和制订治理策略提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1) 马尾松种源内含物与对松材线虫病抗性关系的取样及测定  马尾松种源立地条件、马尾松种源对松材线虫病抗性测定、不同抗性种源间的化学组分差异、游离氨基酸的组成含量测定的取样、分析方法及内含物的活性测定见文献(徐福元，1998；徐福元等，1998b；2000；Zhao et al., 1999)。

2) 马尾松种源抗天牛取食试验取样  将同龄的40个马尾松种源，各剪取1~3年生枝条3~5根，每种源取样4株(重复4次)。

3) 抗天牛取食试验设计及方法  将1~3年生小枝剪回，每树种取3根小枝插入三角烧杯中水培，按试验设计(完全随机区组)排列在①(3.5 m×4 m)养虫室内；②大养虫笼内, 重复4次，按每处理(每株种源树)接种2头天牛成虫置于朝上开门40 cm×50 cm的养虫笼内，让天牛成虫从笼中爬出后, 随机飞翔和寻找寄主，隔日统计天牛成虫在该树种上的停留头数，补充营养取食面积。成虫取食面积采用方格纸法测定，即将取食掉的松树皮缺刻面画在方格纸上后统计和计算取食面积。

4) 抗天牛取食试验频次  分3步进行，即为①初选；②复选；③再复选。每试验在设有4次重复的基础上还各分别进行了3次试验，每次试验观察分为3天1次的第1, 2, 3次测定补充营养的取食面积。试验总量为2 088个样本，其中，①初选是3×3×4×40=1 440个样本，②复选是3×3×4×12=432个样本，③再复选是3×3×4×6=216个样本。每样本3个小枝，试验测定总量为2 088×3=6 264个小枝的数据。

5) 抗天牛取食抗性评价  按松褐天牛成虫对各种源及松种的补充营养取食面积(mean±S.E.)进行方差分析，检验其差异的显著性程度，进行抗性评价比较。

1.2 抗天牛取食种源化学组成分析方法

用气相、液相色谱，气-质联用仪分析松树的萜类、树脂酸类组分和水溶性低分子酚性化合物组成，抗病松种的化学组成差异；用氨基酸分析仪测定游离和固态氨基酸的组成含量、单离差异组分；用核磁共振、红外、紫外等现代光谱法鉴定差异成分的化学结构，并从化学和生理生化角度测定和评价其对松材线虫的作用。1) 从符合研究内容要求的3个马尾松抗性种源中选1个种源和对照，按研究进度要求完成样品的采集和预处理；2) 根据样品的特性，拟订试验方案，进行关键化学成分的提取和分离，然后将分离得到的各类成分进行生物活性试验；3) 提取、分离并供生物活性试验的化学组分类型为：重要单萜及倍半萜类化合物关键组分及树脂酸类化合物；4) 分别进行了1和2年生枝条关键提取物的GC组成分析、数据统计分析。对比研究关键活性化学组成的变化与抗虫性的关系。

2 结果与分析 2.1 马尾松种源对松褐天牛成虫取食的抗性

松褐天牛成虫的羽化出孔始期出现在5月上中旬，出孔高峰期出现在5月下旬和6月上旬，出孔末期出现在7月中下旬或8月上旬。天牛成虫出孔后就寻找松树补充营养取食。

2.1.1 不同马尾松种源上松褐天牛成虫取食测定

不同马尾松种源在形态结构和生理生化指标上分析种源变异属于表现型的，变异是由环境决定的。如种源新梢树皮的紧密和新梢的幼嫩程度，树皮内、针叶内树脂道个数，树脂道直径大小、树脂量及其生理生化指标等均能影响松褐天牛成虫的补充营养取食的选择程度，几个抗性的南方种源均具有上述特点。本试验结果显示马尾松种源抗松褐天牛补充营养取食存在很大差异，尤其是福建2号、广东5号和广东6号3个种源的取食面积最小，说明该3个种源具一定程度的抗松褐天牛补充营养取食的效果，在试验种源由40个缩小至6个时，这3个种源有一定的取食面积(123.7~335.7 mm²)，表现为取食面积均为最小。其原因分析：一是松褐天牛成虫本身的食性较杂；二是马尾松种源对松褐天牛成虫取食是选择水平上的抗性(水平抗性)。从本试验40个种源抗性的初选至复选，其取食面积的差异程度从极显著至显著(Li et al., 2003)。因此，马尾松种源抗松褐天牛补充营养取食的差异虽显著，但仍有一定的取食量。试验也发现广东5号马尾松种源表现为既抗松材线虫病，又较抗天牛成虫补充营养取食(图 1), 该种源有较为广阔的应用前景。

2.1.2 抗松褐天牛成虫取食与化学成分的关系

经过不同抗性马尾松种源1，2年生枝条中性萜类、树脂酸类及中性油脂类化合物的气相色谱-质谱联用分析，发现与抗性明显相关的主要差异组分表现为抗性种源含有更多的单萜烯、倍半萜烯、石竹烯、石竹烯/长叶烯、海松酸、长叶松酸与左旋海松酸、新枞酸等，它们的含量与其松褐天牛成虫取食面积均呈负相关，这表明抗性种源可能具有某种分泌更多上述抗性物质，以提高抵抗松褐天牛成虫取食的能力；同时，也发现与抗性明显相关的主要差异组分表现为高抗种源含有更少的长叶烯，其含量与松褐天牛成虫取食面积均呈正相关，这表明抗性种源可能具有某种分泌更少上述抗性物质，以提高抵抗松褐天牛成虫取食的能力(表 1)。

2.2 马尾松种源对松材线虫病的抗性

本研究发现在抗性马尾松种源和化学成分之间许多明显的相关关系，对指导抗性马尾松种源的选育和进一步开展抗性研究等具有积极的指导意义。

2.2.1 抗性与化学组成的关系

发现中性萜类化合物组成、含量与抗性之间存在明显的相关关系，即与中抗和敏感马尾松种源相比，高抗种源含有更多的长叶烯(相对含量高达32.4%)和α-松油醇等，而含较少的蒎烯，反式石竹烯和β-芹子烯等。接种松材线虫使抗性马尾松种源中某些萜类组分增多，使某些组分减少(徐福元等，2000；Zhao et al., 1999)，表现为高抗种源长叶烯含量与接种天数明显正相关。反式石竹烯和山达海松二烯则呈较明显负相关。而在高抗、中抗和敏感种源中，β-榄香烯均有明显的增加趋势。长叶烯等组分的形成可能会受到松材线虫的刺激，反式石竹烯等可能会被松材线虫消耗。高抗种源可能具有某种分泌更多长叶烯这样的抗性物质以抵抗松材线虫的能力(表 2)。

2.2.2 差异组分提取物对松材线虫的抑制作用

经测定发现与抗性明显相关的主要差异组分存在于中性萜类物质之中，并对主要差异成分进行分离、精制、分析和化学结构鉴定，制得纯品长叶烯、β-石竹烯、α-松油醇、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和l-柠烯等7种化合物，并用于对大量培养的松材线虫的生物活性试验。结果发现：抗性种源的分级提取物对松材线虫的繁殖有抑制作用，而主要差异成分如长叶烯、l-柠烯和α-蒎烯的抑制作用尤为明显(徐福元等，2000)。这些差异成分的浓度与线虫的繁殖量相关，相关性最明显的是α-松油醇、β-蒎烯、月桂烯和l-柠烯等。也就是说，主要存在于抗性种源中的差异成分在马尾松的抗松材线虫能力方面主要起抑制松材线虫繁殖的作用。

2.2.3 水溶性酚性化合物对线虫的抑制作用

高压液相色谱分析发现水溶性部分含有8个主要化学组分。抗性种源含较多组分Ⅲ，敏感种源则含较多组分Ⅰ，Ⅲ和Ⅴ等酚性化合物。将这些酚性化合物加入培养基进行培养线虫试验，抗病种源对线虫繁殖的抑制作用明显地强于敏感种源和轻感种源。这也说明抗病种源含抗松材线虫繁殖的化学物质丰富，因而抗病性强，这与徐福元等(2000)的结果一致。抗性马尾松种源具有独特的抵御松材线虫的能力，实地接种线虫没有引起抗性种源的水溶性组分的明显变化。也就是说，松材线虫对抗性马尾松种源几乎不会构成威胁。

2.3 马尾松种源与松褐天牛成虫取食、松材线虫病抗性的相关性 2.3.1 生长特性与抗性的关系

据观察和测定，不同马尾松种源的形态结构和生长特性均存在差异, 而致使抗病性也存在差异。主要表现在以下几个方面:1) 3个抗病种源的针叶数为2，3针混生, 其中, 3针一束的占22.0%, 2针一束的占78.0%;而感病种源(中带、北带种源)的针叶数均为100%的2针一束。抗病种源针叶数(叶面积)的增加，光合叶面积增加，光合作用增强，提高了种源的生长率和生长势。2) 3个抗病种源每年均有2次新梢生长期(春季和秋季)；而感病种源每年只有1次新梢生长期(春季), 导致了抗病种源的高、径生长明显地强于感病种源。因此，抗病种源的生长势是最旺盛的。3) 抗病种源的树皮厚度为厚皮紧密型，感病种源则为薄皮型。种源的针叶树脂道数也是抗病种源多于感病种源。此因子一则可抑制传媒昆虫天牛补充营养取食，减少因天牛取食造成伤口和传入线虫的机会；二则抗病种源本身每年有2~3次的新梢生长次数(表 3)，生长势相对较旺盛，抗逆性和抗病性也强。

2.3.2 不同种源游离氨基酸含量与抗性的关系

据报道植物体内的氨基酸含量与植物抗病虫害性能有关, 例如, 天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和蔗糖均具有刺激害虫吸食的作用，游离氨基酸含量低是抗虫水稻(Oryza sativa)品种引起褐飞虱(Nilaparvata lugens)拒食的原因之一(徐福元等，1998a)。经分析发现，抗病种源均比敏感和轻感种源含有较低的组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸和精氨酸等10种游离氨基酸。它们的含量与松褐天牛成虫取食面积和松材线虫病感病指数均呈正相关(表 4)，这表明游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松褐天牛成虫补充营养取食和抗松材线虫病。李盾等(1996)和李国清等(1996)建议将几种主要的游离氨基酸作为鉴定或预测未知抗病花生(Arachis hypogaea)和抗虫水稻品种的主要生化指标(徐福元等，1998a)。本试验结果表明不同抗性马尾松种源中的10种游离氨基酸也存在含量较少的趋势。这也反映用游离氨基酸的含量这一生化指标来同时鉴定抗松褐天牛成虫取食和抗病种源也是可能的(表 4)。

3 讨论

从不同马尾松种源的形态结构和生理生化指标方面分析，种源变异属于表现型的，变异是由环境决定的(徐福元，1998)。本试验的复选过程，是从马尾松种源抗松褐天牛补充营养取食差异显著的抗性种源中，选出了广东5号种源，既抗松材线虫病(徐福元，1998；徐福元等，1998b；2000)，又较抗松褐天牛补充营养取食(Li et al., 2003)。广东5号在生产上有较为广阔的应用前景。本研究在初步完成抗性马尾松种源对松褐天牛的抗虫性和对松材线虫病的抗病性评价、抗性生理生化基础与控制原理完成的基础上，经从抗病种源的原产地引进种籽约70 kg，培育了合格的优质抗性马尾松种源苗木近200万株，开展规模造林试验，用抗松褐天牛和抗松材线虫病的马尾松种源于我省城乡、山区的绿化和疫区林分的改造，已造林340 hm²，建立了抗病虫种源松林群落，形成了一定规模的抗性种源群体和规模效益，可为持续治理松褐天牛和松材线虫病提供科学理论和应用依据。同时，该种源造林后对松褐天牛和松材线虫病的抗性的变化正在监测与评价之中, 并利用分子手段从遗传层面研究抗病和抗松褐天牛马尾松种源的抗性机制。

抗性马尾松种源的机制研究发现:1) 接种松材线虫使抗病马尾松种源中某些萜类组分如长叶烯、酚性化合物等增多，而某些组分如反式石竹烯等减少；抗松褐天牛取食种源含有较多的单萜烯、倍半萜烯、石竹烯，而长叶烯含量较少，这可能与松材线虫和松褐天牛的取食习性不同有关。2) 游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松褐天牛成虫补充营养取食和抗松材线虫病，这与游离氨基酸含量低的马尾松种源抗性强的结论是一致的(徐福元，1998；徐福元等，1998a；2000)。3) 抗性种源树皮组织机构的厚皮紧密型和旺盛的生长势也是抗性强的原因。