我国是山茶属(Camellia)植物的分布中心，种质资源丰富(张宏达等，1998)。山茶花瓣中含有丰富的维生素、氨基酸及微量元素等营养物质，其可食性和药用性早已为民间或资料所证实(李斌等，2000)。山茶的花色主要为白色、粉色、红色、深红、紫红等(高继银等，1998)，其花红色色素的成分为花色素及其苷，可开发天然色素(坂田祐介，2004)。山茶属植物杜鹃红山茶(C.azalea)花深红色，在适宜的栽培条件下，一年四季都可以开花(高继银等，2005)，是开发山茶天然色素的良好材料，但目前关于其花色色素开发利用的研究尚未见相关报道。本试验对杜鹃红山茶花色色素的提取条件及其理化性质进行研究，以期为其花色色素的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验材料为杜鹃红山茶花瓣，取自中国林业科学研究院亚热带林业研究所山茶种质园。取杜鹃红山茶盛开期花瓣，洗净擦干后保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2 试验方法 1.2.1 杜鹃红山茶花色色素提取

取5份-20 ℃冰箱中保存的杜鹃红山茶花瓣，每份2.0 g，研磨后按一定比例(质量:体积)加入提取剂，水浴锅内浸提一定时间，冷却后过滤，得红色澄清透明液体。各浸提液分别以相应提取剂作参比，适当稀释后，用上海光谱仪器有限公司的SP-755 PC紫外可见分光光度计在460~600 nm波长范围内扫描(坂田祐介，2004)，比较其最大吸收波长(λ_{vis max})和最大吸收波长处的吸光度值(A_{λvis max})(赵昶灵等，2004a)。

1.2.2 杜鹃红山茶花色色素性质

提取杜鹃红山茶花色色素在4 ℃、黑暗中冷藏备用。浸提液用提取剂适当稀释后，在紫外可见分光光度计460~600 nm波长范围内扫描，其吸收峰为520 nm。检测不同温度、光照下520 nm波长处的最大吸光度值，观察溶液颜色。

浸提液用纯净水适当稀释后加入具塞试管，调节pH 0~9.0，黑暗中静止2 h，在460~600 nm波长范围内扫描，检测最大吸收波长和最大吸收波长处的吸光度值，观察溶液颜色。

浸提液用纯净水适当稀释后，用紫外可见分光光度计在460~600 nm波长范围内扫描，其吸收峰为515 nm。取适量浸提液于具塞试管，分别加入不同浓度的金属离子、氧化剂、还原剂、螯合剂和常用食品添加剂等溶液，混匀后在黑暗中反应2 h，检测515 nm波长处的吸光度值，观察溶液颜色。

2 结果与分析 2.1 杜鹃红山茶花色色素的提取 2.1.1 提取溶剂对花色色素提取的影响

杜鹃红山茶花瓣研磨后以料液比1:10分别加入纯净水、乙醇、甲醇、丙酮和甲酸乙酯的纯浸提溶剂，在pH 4.0，50 ℃条件下浸提1 h，浸提液过滤后适当稀释，紫外可见分光光度计扫描结果见图 1。各浸提液最大吸收波长范围分别为乙醇540~545 nm，甲醇530~535 nm，丙酮、甲酸乙酯525~530 nm，纯净水510~520 nm; 比较各浸提液的最大吸光度值，乙醇的提取效果最好，其次为甲醇和纯净水，而丙酮和甲酸乙脂的提取效果较差，因此选择提取效果较好、较经济且无毒的乙醇作为最佳浸提溶剂。

2.1.2 乙醇浓度对花色色素提取的影响

杜鹃红山茶花瓣研磨后以料液比1:10分别加入浓度为20%, 40%, 60%, 80%和99.7%的乙醇，在pH 4.0, 50 ℃条件下浸提1 h，浸提液过滤稀释后扫描结果见图 2。随乙醇浓度增加，浸提液最大吸收波长范围逐渐升高; 40%乙醇的浸提液最大吸光度值最高，提取效果最好，其次为20%和60%乙醇，80%和99.7%乙醇的提取效果稍差。

2.1.3 浸提时间对花色色素提取的影响

杜鹃红山茶花瓣研磨后以料液比1:10加入40%乙醇，在pH 4.0, 50 ℃时分别浸提0.25, 0.5, 1, 2和4 h，浸提液过滤稀释后扫描结果见图 3。浸提不同时间后浸提液最大吸光度值的波长范围基本上均介于530~535 nm; 比较各浸提液的最大吸光度值，浸提效果0.5 h>1 h>2 h>4 h>0.25 h。

2.1.4 浸提温度对花色色素提取的影响

杜鹃红山茶花瓣研磨后以料液比1:10加入40%乙醇，pH 4.0，30, 40, 50, 60和80 ℃时分别浸提0.5 h，浸提液过滤稀释后扫描结果见图 4。不同温度下浸提0.5 h后浸提液最大吸光度值的波长范围基本上均介于530~535 nm; 比较各浸提液的最大吸光度值，浸提效果40 ℃>50 ℃>60 ℃>30 ℃>80 ℃。

2.1.5 料液比对花色色素提取的影响

杜鹃红山茶花瓣研磨后分别以料液比1:5, 1:10, 1:20, 1:30和1:40[质量:体积(g·mL^-1)]加入40%乙醇，在pH 4.0, 40 ℃时浸提0.5 h，浸提液过滤稀释后扫描结果见图 5。料液比1:5时，浸提液最大吸光度值的波长范围在530~535 nm，其余料液比最大吸光度值的波长范围在535~540 nm处; 随料液比增大，各提取液的最大吸光度值逐渐降低，最佳料液比为1:5。

2.1.6 pH值对花色色素提取的影响

杜鹃红山茶花瓣研磨后以1:5的料液比加入40%乙醇，pH分别调节为2.0, 4.0, 6.0, 8.0和10.0，40 ℃浸提0.5 h，浸提液过滤稀释后扫描结果见图 6。pH 2.0时，浸提液最大吸光度值的波长范围在525~530 nm; pH 4.0时，最大吸光度值的波长范围为530~535 nm; pH 6.0, 8.0和10.0时，浸提液吸光度值随波长增加而降低，吸收峰消失。可见，杜鹃红山茶花色色素在强酸性范围内浸提效果较好，而碱性及弱酸性范围内浸提效果较差。

2.1.7 杜鹃红山茶花色色素提取条件的优化

通过单因素试验，初步确定影响杜鹃红山茶花色色素提取条件的各因素。考虑到各因素间可能存在互作，本试验以乙醇作为提取剂，用料液比(1:5, 1:10, 1:20, 1:30)、乙醇浓度(20%, 40%, 60%, 80%)、浸提温度(30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃)和浸提时间(0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h)，进行5因素(包括1个空白列)4水平的正交试验，综合考虑各因素的影响，优化提取条件。正交试验结果见表 1，由极差(R)值可知，这4个因素的影响大小依次为:料液比>乙醇浓度>温度>时间; 最佳组合为正交设计中的第1个组合，即以20%的乙醇为提取溶剂，料液比1:5，30 ℃浸提1 h的提取效果最好。

2.2 杜鹃红山茶花色色素的性质 2.2.1 温度对色素的影响

不同温度下，随时间延长花色色素最大吸光度值的变化见图 7。15 ℃对花色色素影响不大; 但当温度达30 ℃以上时，A₅₂₀即随处理时间延长而大幅下降，并且温度越高、处理时间越长，A₅₂₀下降越明显，色素的红色越淡。说明杜鹃红山茶花色色素耐热性较差，这可能由于高温导致花色苷降解，生成无色的查尔酮(蒋新龙，2006)。

2.2.2 光照对色素的影响

不同光照下，随时间延长花色色素最大吸光度值的变化见图 8。日光、紫外光、日光灯光和室内自然光均导致花色色素不同程度降解，表现为红色变淡、A₅₂₀持续下降。其中，日光的作用最强烈，表现较为明显，其次分别为为紫外光、日光灯光、室内自然光。说明杜鹃红山茶花色色素对光敏感，具光稳定性差的特点。

2.2.3 pH对色素的影响

不同pH对花色色素最大吸光度值及颜色的影响见表 2。pH 0~5.0时，最大吸收波长为515 nm，pH>6.0时吸收峰消失; A₅₁₅在pH1.0时达最高，pH>1.0后随pH增高A₅₁₅降低。pH 0.0~3.0时呈红色，pH 4.0~5.0时红色变淡，pH>6.0时逐渐显黑色。可见，杜鹃红山茶花色色素在低pH时较稳定，在pH为微酸近中性时变色。

2.2.4 氧化剂、还原剂对色素的影响

氧化剂H₂O₂、还原剂Na₂SO₃对花色色素最大吸光度值的影响见图 9。随氧化剂H₂O₂体积分数增大，A₅₁₅逐渐降低，花色色素颜色逐渐变淡，体积分数达1%时，花色色素由红色变为无色。还原剂Na₂SO₃影响色素稳定性，浓度为0.031 25%时A₅₁₅即迅速下降，0.125%时色素变为无色，但浓度大于0.25%时，A₅₁₅逐渐升高，色素呈现橙黄色，且浓度越高，橙黄色越浓。可见，杜鹃红山茶花色色素抗氧化、还原能力较差。

2.2.5 螯合剂、苯甲酸钠对色素的影响

螯合剂EDTA、防腐剂苯甲酸钠对花色色素最大吸光度值的影响见图 10。随螯合剂EDTA体积分数增大，A₅₁₅逐渐降低，花色色素红色逐渐变淡。苯甲酸钠体积分数增大时，A₅₁₅逐渐降低，花色色素红色逐渐变淡，但浓度大于0.5%时，色素颜色由淡红色变为暗橙色，且浓度越高，颜色越深，而A₅₁₅逐渐升高。可见，杜鹃红山茶花色色素对螯合剂、苯甲酸钠敏感。

2.2.6 糖、食盐对色素的影响

葡萄糖、蔗糖及食盐对花色色素最大吸光度值的影响见图 11。杜鹃红山茶花色色素在葡萄糖、蔗糖溶液中均呈红色，随浓度增大，二者A₅₁₅变化不大，颜色无明显差异。食盐浓度升高导致A₅₁₅明显迅速增大，红色加深，但浓度>2.5%时，A₅₁₅不再大幅变化。可见，葡萄糖、蔗糖对花色色素影响不大，而食盐引起其色泽加深。

2.2.7 柠檬酸、维生素C对色素影响

食品中常用添加物柠檬酸、维生素C对花色色素最大吸光度值的影响见图 12。柠檬酸、维生素C均可使花色色素保持红色，随浓度(体积分数)升高，A₅₁₅迅速增大，红色加深，且柠檬酸效果比维生素C明显。

2.2.8 金属离子对色素的影响

金属离子Co²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, K⁺等均可使杜鹃红山茶花色色素呈现红色，离子浓度越高，红色越深，A₅₁₅越大; Al³⁺, Sn²⁺均使色素呈紫色，且离子浓度越高，紫色越深，A₅₁₅越大(表 3)。低浓度Fe²⁺, Fe³⁺(3.125×10^-4 mol·L^-1)即使色素产生褐色沉淀; Pb²⁺在低浓度时色素呈红色，浓度达3.125×10^-4 mol·L^-1时色素呈暗绿色，12.50×10^-4 mol·L^-1时色素呈现蓝绿色，并出现混浊。可见，杜鹃红山茶花色色素随金属离子及其浓度的不同而呈现不同颜色，Fe²⁺, Fe³⁺, Pb²⁺影响杜鹃红山茶花色色素稳定性。

3 结论与讨论

植物红色素主要有类胡萝卜素和花青素，类胡萝卜素为脂溶性色素，难溶于水和酒精，而花青素是水溶性色素，易溶于水和酸性溶液(吴龙奇等，2004)。杜鹃红山茶花色色素呈现红色，易溶于酸性醇溶液或酸性水溶液等极性溶剂中，难溶于丙酮和甲酸乙酯等有机溶剂，且在酸性和中性条件下的最大吸收波长介于510~545 nm之间，在花青素特征峰变动范围(Holton et al., 1995)，与已有山茶属花色色素的研究一致(坂田祐介，2004; 蒋新龙，2006)。说明杜鹃红山茶的花色色素属于花青素，红色存在由于花色素及其苷(坂田祐介，2004; Sakata et al., 1992)。

不同种类的花青素具特定吸收峰，该吸收峰在不同的介质、环境中可能位移(吴龙奇等，2004)。杜鹃红山茶花色色素在不同提取剂、料液比时，其最大吸收峰所处的波长位置及偏移范围与花青素的光谱特征相符(Holton et al., 1995)。不同pH引起植物色素吸光度变化，可能由于花色素及其苷结构被破坏，当然这种变化具有可逆性(Waterhouse，2002)。浸提温度、时间对杜鹃红山茶花色色素最大吸收波长范围无影响，但低温或短时间及高温或长时间均导致色素吸光度值偏小，可能由于低温或短时间时，色素浸提不完全，而高温或长时间时，部分色素分解(Waterhouse，2002)，从而其吸光度降低。

花色色素提取条件的研究有单因素试验(江丽芳等，2004; 蒋新龙，2006)、正交设计试验(唐克华等，2005)。本研究在单因素试验的基础上进行了正交设计试验，综合分析各因素对杜鹃红山茶花色色素提取的影响。试验结果表明：杜鹃红山茶花色色素的提取工艺以20%的乙醇为浸提溶剂、料液比1:5、30 ℃浸提1 h的提取效果最好，该结果与单因素试验不完全相符，说明各因素间存在互作，具体原因有待于进一步研究。

植物花色色素的性质受温度、光照、pH、氧化剂、还原剂及食品添加剂等影响(赵昶灵等，2004b; 毕见洲等，2007; Mazza et al., 1990; 党蕊叶等，2004; Sarma et al1997)，但不同的花色色素变化不尽一致(彭子模等，1999; 金波等，1994; Weiss et al., 1992)，可能在于植物中花青素种类、结构不同(于晓南等，2002; 白新祥等，2006)，从而表现出不同性质。本试验中金属离子Co²⁺等对杜鹃红山茶花色色素有一定的增色效果，而Fe²⁺, Fe³⁺, Pb²⁺引起色素变色且出现沉淀，主要由于Fe²⁺等离子与花色色素形成金属络合物的原故(Kondo et al., 1992)。

杜鹃红山茶花色深红，适宜条件下一年四季开花。其花色色素提取容易，色泽自然鲜艳，水溶性好，常用食品添加剂葡萄糖、蔗糖对其无明显影响，食盐、柠檬酸等具增色作用。因此，杜鹃红山茶花色色素有望广泛用于食品、饮料等的着色。