DNA甲基化在基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用(陆光远等，2005; Meyer et al., 1994; Ulian et al., 1996; Rossi et al., 1997)。在植物生长发育过程中，DNA甲基化水平过高或过低，都会导致植物形态发生异常。DNA甲基化水平降低的拟南芥(Arabidopsis thaliana)出现了植株矮化、腋芽丛生和叶片变小等异常形态(Finnegan et al., 2000a; 2000b)。泡桐(Paulownia spp.)是我国重要的速生用材和绿化树种之一，但丛枝病发生不仅给泡桐生产造成了巨大的直接经济损失，而且也严重影响了人们种植泡桐的积极性。自从引起泡桐丛枝病发生的植原体被发现以来，人们对泡桐丛枝病发生机制和防治方法进行了大量的研究工作，然而由于其病原———植原体的特殊性，至今没有取得人们预期的效果。近期研究表明:植原体的侵入导致了泡桐DNA甲基化水平的降低(黎明等，2008)，但至目前DNA甲基剂处理对病苗影响的研究国内外还未见报道。因此，笔者通过甲基磺酸甲酯(methylmethane sulphonate，MMS)处理豫杂一号泡桐丛枝病幼苗，研究其对幼苗生长和植原体变化的影响，并对其进行SSR分析，以期为进一步阐明泡桐丛枝病发生机制和建立有效的丛枝病防治方法奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料及处理

将河南农业大学泡桐研究所培养30天的豫杂一号泡桐(Paulownia tomentosa × P. fortunei)丛枝病组培苗从基部剪断，分别转入盛有40 mL浓度为0，20，40，60，80，100和120 mg·L^-1 MMS的1 /2 MS培养基的100 mL三角瓶中，培养基中蔗糖浓度为25 g·L^-1，琼脂为8 g·L^-1。每瓶3个外植体，每个浓度处理20瓶，在温度为20 ℃的黑暗条件下处理5天。然后在温度(25 ± 2) ℃、光强130 μmol·m^-2 s^-1、每天光照时间16 h的条件下培养。

1.2 试验方法

1) MMS处理幼苗生长情况 在MMS处理后的10，20和30天时，分别观察统计幼芽生根率(生根幼芽数/60 × 100%); 同时，参照范国强等(2007)法观察并记录培养30天幼苗的生长情况。

2) 幼苗植原体巢式PCR 不同浓度MMS(除120 mg·L^-1外)处理30天幼苗DNA提取参照范国强等(2003a)方法。植原体16S rDNA巢式PCR扩增引物对为R₁₆mF₁/R₁₆mR₁(5′-CAT GCA AGT CGA ACG GA-3′ / 5′-CTT AAC CCC AAT CAT CGA C-3′)和R₁₆mF₂/R₁₆mR₂(5′-ACG ACT GCT AAG ACT GG-3′ /5′-CGG GGT TTG TAC ACA CCGC-3′) (上海生工生物工程公司合成)。第1次扩增以20 ng泡桐DNA为模板，以R₁₆mF₁/R₁₆mR₁为引物; 第2次扩增以第一次扩增产物稀释50倍为模板，以R₁₆mF₂/R₁₆mR₂为引物。扩增反应体系为25 μL(10 × PCR缓冲液，500 nmol·L^-1引物对，100 μmol·L^-1 dNTP，1.25 U Taq聚合酶，ddH₂O补足25 μL)，2次PCR反应程序均为94 ℃预处理3 min，94 ℃变性1 min，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，5次循环; 然后94 ℃变性30 s，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，25次循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及成像参照范国强等(2007)方法。

3) SSR引物筛选、扩增及电泳分析 参照曹喜兵等(2009)方法从相关木本植物SSR分析引物(上海捷瑞公司合成)中筛选适合泡桐SSR扩增的引物。SSR扩增在Biometra TGradient PCR仪上进行。PCR扩增反应体系为20 μL(10 × PCR缓冲液，300 nmol·L^-1引物对，100 μmol·L^-1 dNTP，0.5 U Taq聚合酶，1 ng模板DNA)。扩增采用Touchdown程序: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性45 s，65 ℃退火45 s (以后每个循环降低0.5 ℃)，72 ℃延伸45 s，30个循环(退火温度视具体引物而定); 94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环; 72 ℃延伸5 min，在扩增产物中加入5.5 μL的Loading Buffer，95 ℃变性5 min。扩增结束后，产物用6%的非梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测。

4) 数据处理 根诱导率经反正弦转换后，采用SPSS12.0统计软件进行多重统计分析并用LSR检验。

2 结果与分析 2.1 MMS对患病幼苗生长影响

MMS对豫杂一号泡桐丛枝病幼苗生长影响结果(图 1和表 1)表明:不同浓度MMS对丛枝病幼苗生长的作用有明显差异。随着MMS浓度由20升高到60 mg·L^-1时，丛枝病幼苗生长上转变为健康幼苗(图 1B~E)，当MMS浓度大于80 mg·L^-1时，部分幼苗顶芽干枯(图 1F)，并且随着MMS浓度的继续升高，顶芽干枯现象越严重(图 1G)。幼芽生根方面，在同一MMS浓度下，随着培养时间的延长生根率逐渐升高; 相同培养时间内，随着MMS浓度升高，生根率逐渐下降。当MMS浓度为120 mg·L^-1时，培养30天的幼芽生根率只有1.7%。此外，随MMS浓度的升高，幼芽生第1条根的时间也逐渐延迟。也就是说，高浓度的MMS抑制了豫杂一号泡桐丛枝病幼苗根的形成。在浓度为20 ~ 80 mg·L^-1范围内，MMS对丛枝病幼苗腋芽生长和顶芽膨大都有明显的抑制作用，并且随MMS浓度的增大，处理幼苗的叶色由淡黄变为淡绿色再到绿色，并披刚毛; 叶片由小变大再变小; 节间距由短变正常再变短。这说明:适宜浓度MMS可使丛枝病幼苗转变为健康幼苗，但浓度过高则可抑制幼苗生长，直至引起幼苗死亡。

2.2 MMS对丛枝病植原体的影响

由MMS处理豫杂一号泡桐丛枝病幼苗的DNA巢式PCR结果(图 2)可以看出:不同浓度MMS对泡桐丛枝病植原体的抑制效果有一定差异。当MMS浓度为20 mg·L^-1时，虽然处理幼苗呈现健康状态(图 1B)，但是其幼苗DNA仍扩增出了植原体16SrDNA特有的1.2 kb条带，即幼苗内有丛枝病植原体的存在; 当MMS浓度为40 ~ 100 mg·L^-1时，处理幼苗内皆未发现丛枝病植原体的存在。这意味着浓度等于或大于40 mg·L^-1的MMS可消除丛枝病植原体的存在，但MMS浓度过大，其在消除丛枝病植原体的同时，也抑制了幼苗的生长。

2.3 MMS处理幼苗的SSR分析

1) 适合泡桐SSR扩增引物的筛选 依照已建立的泡桐SSR反应体系，从核桃(Juglans regia)、板栗(Castanea mollissima)、马尾松(Pinus massoniana)等木本植物的417对SSR引物中筛选出了适合泡桐SSR扩增的45对引物(表 2)。

2) MMS处理幼苗的SSR分析 MMS处理豫杂一号泡桐丛枝病幼苗DNA的SSR扩增结果(图 3)表明:不同浓度MMS处理病苗DNA经SSR扩增后，DNA片段大小和数量没有发生变化。虽然豫杂一号泡桐病苗、20和100 mg·L^-1 MMS处理病苗和豫杂一号泡桐健苗DNA经不同的引物SSR扩增后，产生片段的大小和数量存在一定的差异，但不同处理幼苗DNA经同一引物扩增后出现了谱带数量和片段大小相同的DNA片段。这说明，豫杂一号泡桐健康苗、病苗及浓度等于或小于100 mg·L^-1 MMS处理病苗DNA的SSR扩增位点没有发生变化。

3 讨论

泡桐丛枝病是由植原体侵入而引起的一种传染性病害。自从泡桐丛枝病病原发现以来，对其发病机制进行了大量的研究工作，但至今没有取得预期研究结果。笔者认为:造成该结果的原因一方面可能与人们将精力过多地放在目前仍不能成功体外培养的植原体的研究上; 另一方面在植原体引起寄主发生的生理生化方面进行了大量的研究，而从植原体与寄主相互作用关系源头的研究较少。众所周知，植物生理生化变化是发病后植物代谢出现异常的结果，而不是植物发病的直接原因。植原体侵入导致了泡桐基因表达最终产物———蛋白质的变化(范国强等，2003b; 2006; 2007; 2008)，即丛枝病植原体的存在关闭了健康泡桐体内MW24 ku，pI6.8蛋白质对应基因的表达，而消除泡桐丛枝病幼苗内的植原体，该蛋白对应基因又重新启动表达(范国强等，2005; 2007)。本试验中，笔者用DNA甲基剂———MMS处理豫杂一号泡桐丛枝病幼苗后发现: 20 ~ 100 mg·L^-1 MMS可使丛枝病幼苗转变为健康幼苗，并且浓度等于或大于40 mg·L^-1 MMS处理的幼苗内检测不到植原体的存在。此外，豫杂一号泡桐丛枝病幼苗、健康幼苗、MMS处理后生长呈现健康幼苗及其检测不到植原体存在幼苗的DNA经SSR扩增结果表明，它们DNA的SSR扩增位点没有发生变化。由此可推出，丛枝病植原体侵入或侵入后产生的物质没有引起豫杂一号泡桐DNA在SSR分析水平上碱基的变化，其之所以生长出现丛枝病症状可能与DNA高级结构变化有关。MMS处理可能提高了丛枝病植原体降低的泡桐DNA甲基化水平(黎明等，2008)，使泡桐染色体构型发生变化，从而阻止了泡桐丛枝病发生基因的表达，重新启动了抑制丛枝病发生基因的表达。至于泡桐丛枝病发生与DNA甲基化的密切关系笔者将在以后的论文中报道。