拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)是Mamiya于1979年在松树上首次发现，并认为这种线虫不会引起松树枯萎病(Mamiya et al., 1979)。此后，关于拟松材线虫的致病性问题一直存在争议。一些研究者认为拟松材线虫无致病性(Mc Namara et al., 1988; 黄悦悦等，1999; 柴希民等，2003)，而部分研究者认为拟松材线虫具有微弱的致病性或具有潜在的致病性(Futai，1980; 程瑚瑞等，1986; 胡凯基等，1994; Braasch et al., 1998)。张治宇等(2002)认为浙江舟山的拟松材线虫株系具有一定的致病力。因此，有必要对拟松材线虫的致病性问题进行系统研究，以期为林业生产上管理决策提供技术支撑。本文拟采用23个不同株系的拟松材线虫对黄山松(Pinus taiwanensis)、黑松(P.thunbergii)进行人工接种，探讨拟松材线虫致病性问题。

1 材料与方法 1.1 供试松苗

接种对象为2年生黑松、2年生黄山松实生盆栽苗。置于温室中定期浇水，统一管理。供试苗木情况见表 1。

1.2 供试拟松材线虫株系来源

供试的23个线虫株系均为拟松材线虫，其来源与寄主参见表 2。

1.3 线虫的纯化与培养

参照白兴月等(1992)方法。将玉米粒(30 g)用水浸泡2~3天后(每天换水1次)，装入100 mL的三角瓶中，再加水20 g，高压灭菌(121 ℃，30 min)，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25 ℃培养7天，待菌丝长满三角瓶后，接种经形态鉴定的线虫10条(用0.52%次氯酸钠表面消毒)，25 ℃培养，待线虫将菌丝吃完2/3左右，即可获得纯化好的大量虫株，于4 ℃保存。

1.4 线虫计数

用贝曼漏斗法分离，将线虫收集在10 mL的离心管中，用无菌水洗涤3次，以避免线虫或真菌的分泌物对接种结果的影响。为便于计数，先根据肉眼观察，粗略调出适合浓度，定体积，然后用微量进样器吸取充分混匀的线虫悬浮液50 μL滴成数滴在洁净的载玻片上，置于低倍镜下观察计数。重复3次，取平均值换算线虫浓度及总数。

1.5 接种方法

接种采用人工皮接法。用消毒解剖刀在苗茎干中部偏下的位置由上往下割开树皮，深及木质部，但不超过苗直径的1/3。掀开树皮，塞入合适大小的棉球，然后用透明胶布将树皮和棉球包裹好，最后用微量进样器注入线虫悬浮液。

黄山松接种量为每株5 000条。黑松接种量为每株10 000条。对照接入无菌水。每个拟松材线虫虫株分别接种6株黄山松、6株黑松2年生苗。

1.6 接种后松苗管理

接种后，松苗置于30 ℃左右的人工控温室内。定期浇水，并注意适当控制浇水的时间和浇水量，尽量避免人为的干旱胁迫环境或水分相对充足的环境。

1.7 数据处理

松苗的发病级数，按徐福元等(1994)方法进行划分。每5天观察发病情况，根据发病情况，统计松苗的发病级别。根据级值，可计算出各处理相应的感病指数。

感病指数=∑(各级株数×各级代表数值)×100/调查总株数×发病最重级的代表数值;

发病率=发病株数/接种株数×100%;

死亡率=死亡株数/接种株数×100%。

2 结果与分析 2.1 不同拟松材线虫株系对黄山松的致病性

黄山松接种量为每株5 000条，接种拟松材线虫23天后，接种ZJ1，SLD3号2个株系的黄山松苗各有1株表现发病症状，其梢头开始萎蔫下垂，部分针叶褪绿。62天后，接种ZJ1号、SLD3号2个株系的黄山松苗各有1株出现死亡，而接种清水作对照的黄山松未表现发病症状。随后对具有感病症状以及死亡的黄山松苗进行取样、分离、镜检，均分离到拟松材线虫虫株。对2年生黄山松苗具有致病作用的拟松材线虫株系分别为SFS4，SLD3，ZJ1，KOR1 4个株系，经分离镜检，表现发病症状的黄山松苗体内均分离到拟松材线虫虫株。其感病指数、发病率、死亡率见表 3。

由表 2可知: SFS4，SLD3拟松材线虫株系分别来自四川国有富顺林场、四川泸定县兴隆镇。除上述4个拟松材线虫株系外，其他株系拟松材线虫均未使2年生黄山松苗感病。

2.2 不同拟松材线虫株系对黑松的致病性

对2年生黑松苗，每株接种拟松材线虫10 000条。发病情况见表 4。

2年生黑松接种拟松材线虫不同株系后一直放置在30 ℃左右的人工控温室内，定期浇水，无干旱胁迫环境。接种后第62天，23个拟松材线虫株系中有9个株系对2年生黑松苗具有致病作用，分别是ANL5(图 1a)，ANL7(图 1b)，AHS9，CFL1(图 1c)，SFS1(图 1d)，SFS4，SLD9，SDZ1和HYC1。而接种清水作对照的黑松未表现发病症状(图 1e)。经分离镜检，表现发病症状的黑松苗体内均分离到拟松材线虫虫株。

由表 4可知:这9个具有致病性的拟松材线虫株系中，感病指数最高的ANL5，达到83.3。其次是ANL7，感病指数为54.2。发病率最高的2个拟松材线虫株系同样是ANL5和ANL7，发病率分别为100%和66.7%。死亡率最高的拟松材线虫株系也是ANL5和ANL7，达50%。其次是SFS1，SFS4，HYC1 3个株系，死亡率均为33.3%。

将感病指数大于50、发病率大于50%、死亡率大于50%的拟松材线虫株系划分为强致病性等级; 感病指数大于0而小于50、发病率大于0而小于50%、死亡率大于0而小于50%的拟松材线虫株系划分为弱病性等级; 感病指数为0的拟松材线虫株系划分为无致病性等级。由此，将供试的23个拟松材线虫株系划分为如下3个致病等级:

Ⅰ级(强致病性): ANL5和ANL72个株系; Ⅱ级(弱致病性): AHS9，CFL1，SFS1，SFS4，SLD9，SDZ1和HYC1 7个株系; Ⅲ级(无致病性):ANL1，JLH1，JLH10，JXY7，JYX3，CFL4，SLD3，YWF1，GBL3，ZJ1，HN1，TW1，JAP1和KOR1 14个株系。

3 结论与讨论

通过不同地理来源的23个拟松材线虫株系对2年生黄山松苗、2年生黑松苗的接种试验，发现有4个拟松材线虫株系对2年生黄山松苗具有致病作用，4个拟松材线虫株系分别为SFS4，SLD3，ZJ1和KOR1，且接种ZJ1，SLD3 2个株系的黄山松苗均出现死亡现象，致死率均为16.7%。

对2年生黑松具有致病作用的拟松材线虫有9个株系，分别是ANL5，ANL7，AHS9，CFL1，SFS1，SFS4，SLD9，SDZ1和HYC1。感病指数最高的ANL5，达到83.3。其次是ANL7，感病指数为54.2。发病率最高的拟松材线虫株系同样是ANL5，发病率达100%。死亡率最高的拟松材线虫株系是ANL5和ANL7，达50%。

试验结果表明:拟松材线虫对2年生黄山松、黑松苗具有致病性，且不同地理来源的拟松材线虫株系的致病力差异较大。来自安徽的4个拟松材线虫株系，有3个株系对2年生黑松苗具有致病作用，其中连2个株系(ANL5，ANL7)具有强致病作用。来自四川的5个拟松材线虫株系，有4个株系(SFS1，SFS4，SLD9，SDZ1)对2年生黑松苗具有中等强度的致病作用，而另外1个株系(SLD3)对2年生的黄山松苗具有致病作用。来自江苏的4个拟松材线虫株系(JLH1，JLH10，JXY7，JYX3)对2年生黄山松苗、2年生黑松苗均无致病性。拟松材线虫的致病性是否与地域分布存在某种关系，尚需进一步证实。

近年来，在四川富顺国有林场、大竹县、泸定县一再出现不明原因枯死松树现象，且多数死树体内能够分离到拟松材线虫，是否拟松材线虫对树龄较大的松树具有致病作用，值得进一步研究。

在供试的23个拟松材线虫株系中，对2年生黄山松苗具有致病作用的为4个株系，而对2年生黑松苗具有致病作用的有9个株系，且对黑松的致死作用远大于黄山松。这可能与接种量不同有一定的关系，但更主要是与树种自身的遗传特性有关，即黄山松较黑松更抗拟松材线虫危害。

关于拟松材线虫的致病性问题，张治宇等(2004)测定中国、日本、韩国、加拿大、挪威以及法国的20个拟松材线虫株系对2年生黑松的致病力。将拟松材线虫分为3类:第Ⅰ类致病力很强，致死率大于85%;第Ⅱ类具有较强的致病潜能，在环境适宜的情况下能够造成严重危害; 第Ⅲ类几乎没有致病力。在本研究中，23个供试株系在对黑松苗的反应中同样存在强致病性、弱致病性和无致病性的明显分化。这点与张治宇等(2004)试验结论相一致。