桉树(Eucalyptus spp.)青枯病是由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种系统性土壤传播病害(曹季丹，1982)，对华南地区的桉树生产带来很大危害。青枯菌主要从植物根部侵染(Kelman，1954)，其中，对寄主根部的吸附侵入和根内定殖扩散是其侵染过程的2个重要环节，吸附侵入是其成功侵染的必要条件(罗焕亮等，2002)。微生物和植物之间的吸附侵入是在不断变化的环境条件下完成的，温度、pH值和接种浓度在微生物的吸附侵入过程中发挥着重要作用，在极大程度上决定微生物能否在植物体内成功定殖，如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对曼陀罗(Datura stramonium)(Ohyama et al., 1979)和根瘤菌(Rhizobium sp.)对花苜蓿(Medicago ruthenica)(Munns，1969)的侵入条件进行试验，运用组织学技术研究青枯菌在寄主根表、表皮和木质部的定殖情况，青枯菌对木麻黄(Casuarina spp.)(Álvarez，2008)和桉树及非寄主树木(王军等，2007)的吸附识别进行研究，但对青枯菌与桉树之间的吸附侵入机制的影响因素还没有报道。为更深入探究桉树青枯病的发生机理，本研究通过测定不同温度、pH值和接种浓度下，青枯菌强弱2个菌株接种尾巨桉苗木后的根部吸附量和侵入量，以了解温度、pH值和接种浓度对青枯菌根部吸附侵入过程的影响，进一步探索青枯菌与尾巨桉的识别机制，为桉树青枯病的防控提供支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种

选用从桉树分离的2青枯菌菌株5号(强毒菌株)和12号(弱毒菌株)，由华南农业大学林学院提供。

1.1.2 试验

用苗由中国林业科学研究院热带林业研究所组培中心提供的尾巨桉196(Eucalyptus urophylla×E.grandis，感病品种)组培苗，高度约15~25 cm，除去袋土，水培15~20天，待新根长出后使用。

1.2 试验方法 1.2.1 菌种制备

将供试菌株5号和12号在TTC培养基(Kelman，1954)上30 ℃培养36~48 h，用无菌水配制成3×10⁸个·mL^-1的细菌悬浮液，血球计数板计数，备用。

1.2.2 不同温度条件下青枯菌在尾巨桉根表吸附量和根部侵入量测定

取配好的浓度为3×10⁸个·mL^-1细菌悬浮液600 mL装入1 L烧杯中，分别置于15，20，25，30，35 ℃的光照培养箱内，待菌悬液的温度与培养箱内温度一致后，将桉苗放入其中，根部完全浸没到水中，每个处理5株桉苗，在浸根接种后0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 h分别剪取幼根，测定不同温度条件下青枯菌根表吸附量和根部侵入量。3次重复，结果取平均值，利用Excel和DPS系统进行数据处理和分析。

1.2.3 不同pH值条件下青枯菌在尾巨桉苗木根表吸附量和根部侵入量测定

先用10% NaOH和10% HCl将无菌水pH值调节为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分别配制成浓度为3×10⁸个·mL^-1的细菌悬浮液，然后取600 mL相应pH值的细菌悬浮液放入1 L烧杯中，接种水培桉苗。将桉苗根部完全浸没到水中，每个处理5株桉苗，置于30 ℃的光照培养箱中，在0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 h分别剪取幼根，测定不同pH值条件下青枯菌根表吸附量和根部侵入量。3次重复，结果取平均值，利用Excel和DPS系统进行数据处理和分析。

1.2.4 不同接种浓度下青枯菌在尾巨桉苗木根表吸附量和根部侵入量测定

用无菌水分别配制浓度为3×10⁵，3×10⁶，3×10⁷，3×10⁸，3×10⁹个·mL^-1的细菌悬浮液，取600 mL装入容积为1L烧杯中，然后接种水培桉苗。将水培好的桉苗根部完全浸没到水中，每个处理5株桉苗，置于30 ℃的光照培养箱中，在接种后0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 h分别剪取幼根，测定不同接种浓度条件下青枯菌根表吸附量和根部侵入量。3次重复，结果取平均值，利用Excel和DPS系统进行数据处理和分析。

1.2.5 根表吸附量和根部侵入量测定方法

苗木根表吸附量测定(王军，2007):每株每次剪取1条幼根，距离幼根末端约2 cm，将截取的根尖浸入10 mL无菌水中，涤荡1 min后，取出根尖，用灭菌滤纸吸干外表水分，称质量，用血球计数板计数悬浮液中的细菌数量，即为青枯菌的根表吸附量。

苗木根部侵入量测定:将称重后的根尖放入10 mL无菌水中，磨碎，用血球计数板计数悬浮液中的细菌数量，即为青枯菌的根部侵入量，计算公式为:

细菌浓度(个·mL^-1)=80小格内细菌总数(个)/80×400×10 000×稀释倍数(mL)，

吸附或侵入量(个·g^-1鲜质量)=细菌浓度(个·mL^-1)×分离用水量(mL)/根质量(g鲜质量)。

2 结果与分析 2.1 温度对青枯菌在尾巨桉苗木根部吸附侵入的影响 2.1.1 温度对青枯菌在尾巨桉苗木根表吸附量的影响

由图 1和2可知:在5个温度梯度中，12号和5号2菌株表现出相似的变化趋势。30 ℃时2菌株的根表吸附量最高，12号在6.0 h最高可达到1.02×10⁹个·g^-1 FW，5号在6.0 h最高可达到1.17×10⁹个·g^-1 FW，35 ℃时次之，25 ℃时有所下降，20和15 ℃时吸附量最低。所有温度梯度范围内，2菌株的吸附量都随时间的延长呈上升趋势，在相同条件下，5号菌株的根表吸附量总体高于12号菌株，表明强毒菌株的吸附能力强于弱毒菌株。分别对2菌株在不同温度下的根表吸附量进行方差分析，结果表明:不同温度下青枯菌在尾巨桉根表的吸附能力有极显著差异(P < 0.01)。多重比较结果显示: 12号和5号菌株在30 ℃时的根表吸附量与其他温度下的吸附量相比均具有极显著差异。

2.1.2 温度对青枯菌在尾巨桉苗木根部侵入量的影响

由图 3和4可知:在30 ℃时，12号和5号菌株的根部侵入量都达到最高，35 ℃时次之，在25 ℃时中等，15 ℃时最低。随着时间的延长，2菌株的根部侵入量都逐渐增大。在5个温度梯度中，12号和5号菌株根部侵入量具有相似的变化趋势，但2者略有差异，在30 ℃时，12号在6.0 h达到最高9.19×10⁹个·g^-1 FW，而5号在4.0 h已达到最高9.22×10⁹个·g^-1 FW。分别对不同温度下2菌株的根部侵入量进行方差分析，结果表明:温度对青枯菌在尾巨桉根部侵入能力具有显著影响，不同温度下12号菌株的根部侵入量具有显著差异(P=0.014 3 < 0.05)，不同温度下5号菌株的根部侵入量具有极显著差异(P=0.000 5 < 0.01)。多重比较结果显示:在30 ℃时2菌株的根部侵入量最高，与其他温度下的侵入量相比均具有极显著差异。

2.2 pH值对青枯菌在尾巨桉苗木根部吸附侵入的影响 2.2.1 pH值对青枯菌在尾巨桉苗木根表吸附量的影响

如图 5和6所示:在pH7.0时，2菌株的根表吸附量都最高，12号菌株和5号菌株最高分别为9.60×10⁸和1.02×10⁹个·g^-1 FW，在pH6.0时，吸附量比pH7.0时都有所下降，pH8.0吸附量低于pH6.0但高于pH5.0时的吸附量，pH9.0时青枯菌的吸附量最少，12号和5号在6.0 h最高仅为5.51×10⁸和5.67×10⁸个·g^-1 FW。分别对2菌株在不同pH条件下的根表吸附量进行方差分析，结果表明:不同的pH值条件对强弱菌株在尾巨桉的根表吸附量都具有极显著影响(P=0.000 1 < 0.01，P=0.000 1 < 0.01)。多重比较结果显示: 12号菌株在pH7.0和pH6.0时的根表吸附量没有显著差异，但与其他pH值时相比均有极显著差异，5号菌株在pH7.0和pH6.0时的根表吸附量也没有显著差异，但与其他pH值时相比均有极显著差异。

2.2.2 pH值对青枯菌在尾巨桉苗木根部侵入量的影响

如图 7和8所示:在pH7.0时2菌株的根部侵入量最高，12号在6.0 h时达最高9.41×10⁹个·g^-1 FW，5号在6.0 h时最高达到9.63×10⁹个·g^-1 FW; 在pH6.0时根部侵入量与pH7.0相比都有所下降，12号菌株下降程度不如5号明显; 在pH8.0时，在开始的1.0 h内，2菌株的侵入量与pH6.0基本一致，在之后的时间里，二者的侵入量均小于pH6.0时的侵入量; 在pH5.0时，青枯菌的侵入量进一步下降，在pH9.0时，菌株的侵入量降到最低，12号和5号的降幅不同，12号下降更明显。分别对2菌株在不同pH条件下的根部侵入量进行方差分析，结果表明:不同的pH条件青枯菌在尾巨桉根部侵入量具有极显著差异(P=0.000 1 < 0.01，P=0.000 1 < 0.01)。2菌株在pH7.0时的根部吸附量与其他pH值时相比均具有极显著差异。

2.3 不同接种浓度对青枯菌在尾巨桉苗木根部吸附侵入的影响 2.3.1 不同接种浓度条件下青枯菌在尾巨桉苗木根表吸附量

由图 9和10可知:当接种浓度为3.0×10⁹个·mL^-1时，12号和5号2菌株的吸附量都最高，12号在6.0 h时达到最高1.16×10⁹个·g^-1 FW，5号在6.0 h时达到最高1.25×10⁹个·g^-1 FW; 当接种浓度为3.0×10⁸个·mL^-1时，2菌株的吸附量都有所下降; 浓度为3.0×10⁷个·mL^-1时，2菌株的吸附量进一步降低; 当接种浓度为3.0×10⁵个·mL^-1时，2菌株的吸附量亦最低。随时间延长2菌株的根表吸附量都呈上升趋势，5号菌株的吸附量总体高于12号菌株。分别对2菌株在不同接种浓度时的根表吸附量进行方差分析，结果表明:不同接种浓度下青枯菌在尾巨桉根表吸附量具有极显著差异(P=0.000 1 < 0.01，P=0.000 1 < 0.01)，多重比较结果显示: 2菌株在浓度为3.0×10⁹个·mL^-1时的根表吸附量与其他接种浓度相比均有极显著差异。

2.3.2 不同接种浓度条件下青枯菌在尾巨桉苗木根部侵入量

由图 11和12可知:当接种浓度为3.0×10⁹个·mL^-1时，2菌株的根部侵入量达最高，12号的根部侵入量在4.0时达最高9.92×10⁹个·g^-1 FW，5号在6.0 h时达到最高1.06×10 10个·g^-1 FW; 当接种浓度为3.0×10⁸个·mL^-1时，12号在4.0 h前，侵入量低于3.0×10⁹个·mL^-1时的侵入量，在4.0和6.0 h时侵入量变化较小，5号在整个接种时间内，侵入量与浓度为3.0×10⁹个·mL^-1时相比下降不明显; 接种浓度降低为3.0×10⁷个·mL^-1时，2菌株的根部侵入量明显降低; 当接种浓度为3.0×10⁵个·mL^-1时，2菌株的侵入量最低，12号和5号在6.0 h分别仅为5.38×10⁹和6.16×10⁹个·g^-1 FW。在整个接种时间内，随着时间延长，2菌株根部侵入量都呈现上升趋势，5号菌株的根部侵入量基本都高于12号菌株。分别对2菌株在不同接种浓度时的根部侵入量进行方差分析，结果表明:不同接种浓度下青枯菌在尾巨桉根部侵入量具有极显著差异(P < 0.01)。多重比较结果表明: 12号菌株3.0×10⁸和3.0×10⁹个·mL^-1 2浓度之间差异不显著，而与其他3个浓度相比根部侵入量具有极显著差异，5号菌株结果类似。表明在一定浓度范围内，接种浓度越高，根部侵入量也越高，但过高的接种浓度，其侵入量并不继续增加。

3 结论与讨论

识别作用是病原和寄主相互感知的第一个环节，是通过病菌对寄主的吸附来实现的(Lippincott et al., 1984)，吸附识别作用发生在病菌和寄主植物的细胞之间。在植物表面周围，当细菌借趋向运动与寄主接近到一定程度时，菌体与植物表面的正向和反向物理作用力达到平衡，菌体与植物细胞间的接触不牢固，容易受到机械力吸附，这个阶段称为可逆性吸附，一般时间较短。随着时间的延长，吸附作用增强，菌体与寄主表面的作用力由热力学力转变为生化结合力，借助菌毛或纤维素微纤丝的作用，吸附由可逆状态转变为不可逆状态(Marshall，1975)。在自然条件下，青枯菌在尾巨桉根部的吸附侵入时刻受到环境中温度、pH值、细菌的数量及湿度等不同因子的影响。在环境条件适宜时，有利于病菌的吸附和侵入，在环境条件不适宜时识别受阻甚至失败。

本试验结果表明:青枯菌对尾巨桉苗木根部吸附侵入的最适温度为30 ℃，此时强弱菌株的根表吸附量和根部侵入量都达到最高，35 ℃时次之，25 ℃时更少。这可能是在30 ℃的温度条件下，青枯菌代谢更活跃，运动能力更强，菌体与细胞表面的热力学力更容易转变为生化结合力，因而有利于青枯菌的吸附侵入。而过高或过低的温度，可能不利于菌体的代谢和活动。有研究表明:根瘤菌(Rhizobium japonicum)对大豆(Glycine max cv.Hardee)根部的吸附最适温度为27 ℃，温度高于或低于27 ℃，其吸附能力均呈现衰减趋势(Steven，1984)。使用浓度为3×10⁸ CFU·mL^-1青枯菌悬浮液接种番茄(Lycopersicon esculentum)发现:在25 ℃以上时，9天或更短时间就表现青枯病症状，在温度30与25 ℃的病情指数没有显著差别，但30 ℃潜育期短，只需5天，25 ℃潜育期稍长，则需9天(卓国豪，2005)。说明适宜的条件不仅有利于青枯菌的吸附，也有利于侵入，这与本试验的结果相一致。在我国华南地区，夏季高温多雨的气候条件，为青枯病的发生提供有利条件。

在对pH值的研究中发现:在pH6.0或pH7.0的环境中，强弱菌株的根表吸附量和根部侵入量都很高，说明中性或弱酸性的环境有利于青枯菌的侵入和增殖。微生物和寄主发生吸附侵入作用部位的pH值能够影响微生物的新陈代谢活性和作用部位的各分子的电荷数，在适宜的pH值条件下，细菌的新陈代谢活跃，运动能力强，有利于细菌的运动。pH值的不同能够改变细胞表面各分子的电荷数，影响氢键的形成，对吸附侵入有促进或抑制作用。Munns(1969)发现当pH值由4.5增加至5.6时，根瘤菌对花苜蓿(Medicago ruthenica)的致瘤能力由无增至最大。根癌农杆菌对培养的曼陀罗细胞吸附的最适pH值为6.0(Ohyama et al., 1979)，青枯菌与桉树苗木发生吸附识别的部位是在植物的根际，根际环境的pH值在一定程度上决定细菌能否成功对寄主进行吸附识别，当根际周围形成适宜的pH值条件时，有利于青枯菌的吸附和侵入，容易引起寄主发病。因此，在防治青枯病时可采取一定的措施，改变根围环境的酸碱度，创造不利于青枯菌吸附侵入的环境条件，降低青枯菌的侵染能力，从而一定程度上减少青枯病的危害。

浓度接种试验结果显示:当接种浓度为3.0×10⁸和3.0×10⁹个·mL^-1时，强弱菌株的吸附量和侵入量都很高，说明高接种浓度有利于青枯菌在尾巨桉根部的吸附侵入。卓国豪(2005)的研究也表明:接种高浓度的青枯菌，番茄的病情指数也相对较高，与本试验结果相一致，分析可能是高浓度的青枯菌能克服细胞表面的防卫机制，在细胞表面吸附定殖的机率更大。试验中还发现:随着接种浓度的逐渐升高(3.0×10⁵，3.0×10⁶，3.0×10⁷，3.0×10⁸个·mL^-1)，青枯菌的根表吸附量和根部侵入量都呈上升趋势，但是当接种浓度为3.0×10⁹个·mL^-1时，与3.0×10⁸个·mL^-1相比，青枯菌的根表吸附量和根部侵入量都没有明显上升，分析可能是受根表吸附位置的影响，当细菌浓度较低时，根表有相对多的吸附位置可占用，有相对多的细菌就可以吸附到根表; 而使用过高浓度的菌悬液进行接种时，受根表吸附位置的限制，青枯菌的根表吸附量和根部侵入量没有明显增加。

在温度、pH值和接种浓度条件改变时，尽管强毒弱毒菌株的吸附量和侵入量的变化趋势基本一致，但2者受到的影响程度有一定差异，12号菌株受外界条件改变的影响要大于5号菌株，在pH5.0时，12号菌株的根部侵入量的下降幅度比5号菌株明显。这可能是由于弱毒菌株侵入寄主的能力较差，抵抗外界环境条件改变的能力也弱，使得外界环境条件的改变对弱毒菌株的影响大于强毒菌株。

综上所述，温度、pH值和接种浓度是影响青枯菌对尾巨桉根部吸附和侵入的3个重要因素，其在病原菌和寄主的互作过程中发挥重要作用，这对深入研究青枯菌对桉树的吸附识别过程具有重要参考意义。