石榴(Punica granatum)为石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica)落叶灌木或小乔木，原产伊朗、阿富汗等中亚一带，从西汉张骞出使西域将涂林安石榴引入我国，石榴作为水果和观赏树木在我国已有2 000多年的栽培历史。经长期天然杂交和基因突变，以及采用实生、分株、嫁接等多种繁殖方法，产生了复杂而多样的品种和类型，据不完全统计，我国现有石榴品种资源200多个，遍及南北各地20多个省区，形成了山东枣庄、新疆叶城、陕西临潼、安徽怀远、河南开封、云南蒙自和四川会理等著名的栽培区(汪小飞，2007)。近年来，随着石榴的营养及药用价值的发掘，国内外对石榴品种资源的调查和分类研究也越来越多，除应用形态学、细胞学和生化水平的品种分类外(汪小飞，2007)，也有学者应用分子标记对石榴品种资源进行调查和分类研究，如应用RAPD标记对中国及突尼斯部分石榴品种进行了研究(杨荣萍等，2007; 热娜·卡司木等，2008; 卢龙斗等，2007; 巩雪梅，2004; Coşkun et al., 2008)，应用SRAP标记对中国部分石榴品种及印度部分石榴品种进行了研究(张四普等，2008; Ranade et al., 2009)，应用AFLP标记分别对中国(其中包括5个川滇石榴品种)和突尼斯部分石榴品种进行了研究(苑兆和等，2008; Jbir et al., 2008)，为石榴种资资源的研究提供了分子依据。

AFLP技术以其准确、高效的特点在植物的亲缘关系、遗传图谱构建、抗病性研究等方面的应用已十分广泛(乔勇等，2009; 闵会等，2009; 臧德奎等，2009; 韩远记等，2008; 陈良华等，2009; 马庆华等，2009)。石榴在云南引种栽培后，形成40余个地方品种，在四川引种栽培后，形成10余个地方品种，这些品种间的亲缘关系和系统演化并不清楚，且目前尚未有针对川滇石榴品种利用AFLP技术进行研究的报道，为了明确四川、云南石榴品种间的遗传多样性和亲缘关系，本研究利用AFLP标记技术对四川、云南石榴的遗传多样性与亲缘关系进行分析，以期为石榴种下分类提供分子依据，为更合理地保护四川、云南石榴资源及选育新品种提供遗传信息。

1 材料与方法 1.1 材料

供试42个石榴品种于2008年4月采自云南蒙自县石榴研究所石榴品种资源圃、会泽县果园，四川会理县农业局石榴品种资源圃、攀枝花市果园(表 1)。每个品种选3~5株健壮、无病虫害石榴树采30~50片嫩叶，装于自封口塑料袋中，用冰壶运回，于-70 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1) DNA提取及检测  采用改良CTAB法从石榴幼叶中提取基因组DNA(赵丽华等，2009)，并稍加改进: CTAB裂解液加入硼砂终浓度为0.015 mol·L^-1，65 ℃水浴1 h。0.8% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，biospec-mini DNA/RNA/protein核酸蛋白分析仪测定DNA含量，最后稀释为100 ng·μL^-1工作液，放入-20 ℃冰箱里备用。

2) AFLP分析  酶切:MseⅠ、EcoR Ⅰ内切酶购自NEB公司。20 μL酶切体系为: DNA模板3 μL (100 ng·μL^-1)，MseⅠ及EcoRⅠ各5 U，BSA(100 μg·mL^-1) 0.2 μL，NEBuffer2为2 μL，加ddH₂O至20 μL混匀后，37 ℃恒温酶切6 h，65 ℃灭活20 min。

连接: T4 DNA连接酶购自NEB公司，MseⅠ接头、EcoRⅠ接头、预扩和选扩引物序列参照周延清(2005)报道，由上海英骏生物技术有限公司合成。20 μL连接体系: MseⅠ和EcoR Ⅰ接头(20 mmol· L^-1)各0.5 μL，T4 DNA连接酶2 U，T4 DNA连接酶缓冲液2 μL，酶切过的DNA样品15 μL，加ddH₂O至20 μL，16 ℃恒温3 h以上。

预扩增: Taq DNA聚合酶购自宝生物工程有限公司。25 μL预扩增反应体系:连接产物作预扩模板取2 μL，Mg²⁺ (25 mmol·L^-1) 1.5 μL，dNTPs (2.5 mmol·L^-1) 1.5 μL，MseⅠ-C和EcoR Ⅰ-A预扩引物(10 mmol·L^-1)各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U，10×PCR Buffer 2.5 μL，加ddH₂O至25 μL混匀。预扩程序: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30个循环; 72 ℃ 6 min，4 ℃保存。预扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

选择性扩增:预扩增产物稀释10倍作选择性扩增的模板，取2 μL，Mg²⁺ (25 mmol·L^-1)1.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L^-1) 1.5 μL，MseⅠ和EcoRⅠ选扩引物(10 mmol·L^-1)1 μL(表 2)，Taq DNA聚合酶1 U，10×PCR Buffer为2.5 μL，加ddH₂O至25 μL，混匀。选扩程序为94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共12个循环，退火温度每循环下降0.7 ℃; 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共23个循环; 72 ℃ 6 min，最后4 ℃保存。选扩产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。每对引物重复1次。

电泳及银染:选扩增产物加5 μL上样缓冲液(98%甲酰胺，10 mmol·L^-1 EDTA，pH 8.0，0.25%二甲苯氰，0.25%溴酚蓝)，经95 ℃变性10 min后，置于冰上备用。制备6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，预电泳(电压1 800 V)至胶板温度为40 ℃以上，上样选扩产物8 μL继续电泳，2.5 h后停止电泳。凝胶采用银染方法显带，银染法按宋国立等(1999)的方法进行，干燥后，拍照保存。

1.3 数据处理

采用Cross Checker-2.91版软件对2次重复试验中稳定出现的条带进行统计，在相同迁移位置上有带记录为1，无带记录为0，统计各对引物的扩增位点，建立“0，1”二元数据矩阵。用PopGen32软件计算等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、Nei's基因多样性(H)、Shannon信息指数(I)、多态位点百分率(P)。用NTSYSpc-2.10版软件计算42个石榴品种间遗传相似系数(S_g)，用UPGMA法构建亲缘关系聚类树状图。

2 结果及分析 2.1 DNA检测

由琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA，结果显示:点样孔干净，DNA主带清晰，无弥散现象; 由核酸蛋白仪检测结果显示: OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.805~1.884之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀值大于2.0。结果表明，所提石榴基因组DNA符合AFLP标记的要求。

2.2 AFLP扩增产物多态性

从64对EcoR Ⅰ/MseⅠ引物中筛选出多态性好的5对引物(表 2)对42个石榴品种进行AFLP扩增，由琼脂糖凝胶电泳可见预扩增及选择性扩增产物(图 1)呈弥散状，片段集中于50~750 bp。6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离5对选扩引物产物，共统计到362条DNA条带，平均每对引物扩增条带数为72.4条，其中多态性条带为235条，平均每对引物扩增多态性条带为47条，多态性条带比率为65.66%。

利用PopGen32软件对石榴选择性扩增的DNA条带进行分析(表 2)，5对引物扩增产物多态性百分率在55.56%~75.93%之间。其中引物对E-AAG/M-CAA扩增条带数最少，为54条，但多态性条带比率最高(75.93%); 引物对E-ACA/M-CTC扩增条带数最多，为94条，但多态性比率较低(60.64%)。结果表明，采用不同的引物对进行石榴选择性扩增，扩增出的谱带数差异较大，但多态性谱带的比例差异不大。每个位点的等位基因数(N_a)为1.555 6~1.759 3，平均1.656 6;有效等位基因数(N_e)为1.211 1~1.310 8，平均1.260 7; Nei's基因多样性(H)为0.132 0~0.194 1，平均0.160 3; Shannon信息指数(I)为0.210 2~0.303 8，平均0.253 1;多态性条带比率为65.66%。结果表明，四川、云南石榴品种资源间存在较丰富的遗传多样性。

2.3 DNA指纹图谱

相同的AFLP引物对于不同石榴品种扩增出带数及带型都不同，42个四川、云南石榴品种检测到18条品种特异性条带(表 2) : E-AGG/M-CAA引物对于会泽‘花红皮’200 bp左右有1条独特DNA条带，巧家‘红壳石榴’100 bp左右有1条独特DNA条带; E-AAG/M-CAA引物对于开远‘汤碗石榴’300 bp及250 bp左右各有1条独特DNA条带，蒙自‘厚皮甜砂籽’280 bp左右缺失1条DNA条带; E-ACA/M-CTC引物对于会泽‘白花石榴’700 bp左右有1条独特DNA条带，会理‘软核酸石榴’600 bp左右有1条独特DNA条带，会理‘青皮软籽’250 bp左右缺失1条DNA条带; E-AGG/M-CTG引物对于会泽‘白花石榴’700 bp左右有1条独特DNA条带，元谋‘姜驿石榴’650 bp左右有1条独特DNA条带，会泽‘花红皮’500 bp左右有1条独特DNA条带，蒙自‘青皮石榴’150 bp左右有1条独特DNA条带; E-AAG/M-CTG引物(图 2)对于蒙自‘甜光颜’750 bp及630 bp左右各有1条独特DNA条带，禄丰‘红皮白籽’380 bp左右有1条独特DNA条带，蒙自‘白花甜石榴’140 bp左右有1条独特DNA条带，会泽‘绿皮酸’ 640 bp左右缺失2条DNA条带。此14条独特及4条缺失特异性DNA条带可作为石榴品种的特征带，用于鉴定供试石榴品种中这13个石榴品种的分子依据。

2.4 聚类分析

42个石榴品种的遗传相似系数(S_g)为0.712 7~0.925 4，平均为0.814 2;其中会泽‘莹皮’和建水‘酸甜石榴’与开远‘汤碗石榴’遗传相似系数最小，为0.712 7，表明前二者与后者间亲缘关系最远; 攀枝花‘大绿籽’为会理‘青皮软籽’芽变品种(先开泽，1999)，遗传相似系数最大，为0.925 4，表明二者亲缘关系最近。

利用UPGMA法，根据S_g构建42个石榴品种遗传关系聚类图(图 3)。从图 3可以看出，5对引物能将42个石榴品种完全区分开，以S_g 0.820 0为阀值，供试的42个石榴品种可分为4类: ‘红皮白籽’、‘大铁壳红’、‘红皮酸’、‘大籽酸石榴’、‘莹皮’、‘酸甜石榴’、‘汤碗石榴’、‘白皮石榴’、‘铜壳石榴’、‘黑皮石榴’、‘厚皮甜砂籽’、‘花红皮’、‘红壳石榴’、‘会理红皮’、‘青壳石榴’、‘白花石榴’、‘糯石榴’、‘永丰早白石榴’聚为第Ⅰ类; ‘红皮红籽’、‘甜绿籽’、‘黄皮甜’、‘青皮石榴’(蒙自)、‘青皮白籽’、‘火炮石榴’、‘软核酸石榴’、‘青皮软籽’、‘大绿籽’、‘甜光颜’、‘酸绿籽’、‘火石榴’、‘绿皮酸’聚为第Ⅱ类; ‘铁壳白籽’、‘青皮石榴’(攀枝花)、‘黄皮酸’聚为第Ⅲ类; ‘白花甜石榴’、‘酸光颜’、‘红袍’、‘姜驿石榴’、‘水晶石榴’、‘细籽酸石榴’、‘乍甸酸石榴’、‘绿皮甜酸’聚为第Ⅳ类。蒙自‘青皮石榴’与攀枝花‘青皮石榴’遗传相似系数为0.795 5，且分别居于第Ⅱ类与Ⅲ类，应为同名异物。

3 讨论

多态带百分率(P)、有效等位基因数(N_e)、Nei's基因多样性(H)与Shannon信息指数(I)是度量遗传多样性常用指标(Martins et al., 2009; 张青林等，2004)。本研究结果显示，42个四川、云南石榴品种间遗传相似系数(S_g)变异范围在0.712 7~0.925 4之间，变幅较大，P，等位基因数(N_a)，N_e，H，I分别为65.66%，1.656 6，1.260 7，0.160 3，0.253 1，表明四川、云南石榴品种在遗传进化过程中基因组DNA发生了较大变异，构成较丰富的遗传多样性。本试验的结果高于Yuan等(2007)用AFLP对四川、云南石榴群体的分析结果(P，N_a，N_e，H，I分别为24.31%，1.243 1，1.139 7，0.082 1，0.123 9)，这可能是由于其在研究中仅选取四川、云南5个主栽品种进行分析，不能完全代表四川、云南石榴品种间的遗传多样性，致使多样性分析结果偏低。本研究中四川、云南的42个品种多态带百分率为65.66%，低于Yuan等(2007)用AFLP对中国石榴品种分析所得多态位点百分率(72.70%)，及Jbir等(2008)用AFLP对突尼斯栽培石榴品种分析所得多态带百分率(94.7%)。表明石榴在四川、云南经多年的实生繁殖、人工选育及基因突变的积累，虽然产生了较大的遗传变异，构成了较丰富的石榴资源基因库，对石榴优良品种的选育是极为有利的，但其遗传多样性低于突尼斯及全国石榴的遗传多样性，为了进一步丰富四川、云南的石榴资源基因库，可从我国其他地区或国外引种石榴品种。

目前，我国对石榴品种资源的分类还没有统一的方法，生产上多以用途、花色、风味、果型大小、果皮色泽、籽粒口感、成熟期等进行分类(汪小飞等，2007)。从本研究利用AFLP标记技术对42个四川、云南石榴品种聚类的结果(图 3)看，与传统分类的结果相差较远。从风味看，4类都有甜味和酸味石榴; 从果皮颜色看，果皮为青色的巧家‘青壳石榴’聚于第Ⅰ类，禄丰‘青皮白籽’、蒙自‘青皮石榴’、会泽‘绿皮酸’、会理‘青皮软籽’、攀枝花‘大绿籽’聚于第Ⅱ类，攀枝花‘青皮石榴’聚于第Ⅲ类，会泽‘绿皮甜’聚于第Ⅳ类; 而且这些石榴品种也没有按照地域分布分类。本文结果与卢龙斗等(2007)、Coşkun等(2008)、Jbir等(2008)、廖毅等(2009)利用分子标记聚类分析结果一致，即AFLP分类与形态和地理起源分类不一致。这可能是基因突变的重演性，在不同地区同种生物的不同个体中发生相同的基因突变(朱军，2002)，导致石榴品种间表现相同某一性状，并稳定遗传，而这些品种间遗传相似系数却较低，不能聚为一类; 由于四川、云南各石榴栽培区域地理位置接近，彼此频繁引种，不同生态类型、地域间基因交流广泛，及环境对数量性状的巨大影响，有些品种分子标记结果遗传相似系数较高，聚为一类，但形态特征、地理来源却差异较大。传统的分类法仅依据可见差异进行分类，对一些不可见的差异无法进行检测分析，分析不全面，因此，单纯依据植物的形态和地理起源分类，已经不能真实反映石榴品种间的遗传背景和遗传差异; 而AFLP标记技术能从DNA水平上揭示遗传变异，反映遗传背景差异。对石榴种质资源进行深入研究时，应在形态学基础上，应用分子标记技术进行分析，才能更好地为石榴种质资源保存、利用及品种改良等提供科学依据。