植食性螨个体小、繁殖快、种群密度大，在大量使用农药杀灭防治的同时，螨类产生抗药性和引起再猖獗的现象尤为突出，寻找新型杀螨剂已成为植保工作者的一个重要课题。目前中国农药市场上的杀螨剂大多依赖进口，进口杀螨剂的费用占总进口农药费用的88.8%;而且螨类对作物造成的损失，在过去30年有了明显的增加。因此，使用专性杀螨剂成为防治植食性螨类的主要措施，杀螨剂的发展必然朝着高效、广谱、低毒、安全的生物农药及昆虫激素型农药方向发展，满足市场的需求(赵莉蔺等，2004)。深入研究杀螨剂的作用机制并设计全新化学结构的先导化合物，仍是寻找新型杀螨剂的主要途径。大戟狼毒(Euphorbia fischeriana)作为新开发的植物源农药之一，已有用于杀虫方面的报道。为了更好地将其研发为植物源杀螨剂，本文以朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)为对象，对大戟狼毒活性成分EFPE-11的杀螨作用机制进行初步研究，旨在为新型植物性杀螨剂的开发提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试材料

试验所用大戟狼毒采山西省沁水县中村镇(5月)，按植物的不同部位(根、茎、叶)进行采集，采集到的植物材料洗净后在室内阴干(约25 ℃)，放入恒温箱内(40~45 ℃)烘干，磨碎，过60目筛，放入冰箱中储藏备用。

朱砂叶螨为室内饲养的敏感品系:养虫室的温度(25 ± 1) ℃，相对湿度(50 ± 10) %，光照(L: D)为18 h: 6 h。

1.1.2 化学药品

石油醚、三氯甲烷、甲醇、土温-80、考马斯亮蓝G-250、DTNB、毒扁豆碱、醋酸-α-萘酯、醋酸-β-萘酯、坚牢蓝RR盐。

1.1.3 主要仪器

水浴恒温震荡器、160 ×双目立体显微镜、721A型分光光度计、SIGMA高速冷冻离心机、1702-MP8型电子天平。

1.1.4 EFPE-11活性流分的制备

将大戟狼毒根粉50 g，加入干粉5倍量的石油醚，室温下(30 ± 2) ℃浸泡3~5天后，过滤并浓缩至稠膏状。称取一定量的提取物，采用常压柱层析进行分离，所得各流分经薄层层析(TLC)后，相同成分者合并，收集到的各流份减压浓缩后，利用玻片浸渍法(FAO，1980)进行生物活性测定，确定活性最高流分，得到EFPE-11，4 ℃下备用。

1.2 EFPE-11引起的螨类毒性症状观察

叶碟浸渍法(leaf disk dip method) (朱丽梅等，2002) :取平展的苹果(Malus pumila)叶片洗干净，叶面朝下放到水培养台上，每一叶片挑入成螨20头以上，待成螨稳定后，夹取叶片浸入药液5 s，对照为清水，将叶面朝下放到水培养台上，叶片边缘用湿棉条围住，防止螨体逃逸。从2~24 h每隔2 h观察1次成螨的状况，并记录其活动情况及反应。处理浓度分别为2，1，0.5，0.25 mg·mL^-1。

1.3 酶活性测定 1.3.1 蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝G-250法。酶液制备:分别在触杀处理后4，8，12，16，20，24 h时取朱砂叶螨雌成螨100头，加0.25 mL生理盐水冰浴中匀浆后，10 000 r·min^-1，4 ℃下离心15 min，取上清液备用。蛋白含量测定:取酶液0.1 mL于试管中，对照管中则加入0.1 mL磷酸缓冲液，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，25 ℃水浴加热2 min，于595 nm波长处比色测定OD值。根据标准曲线计算出蛋白质含量。

1.3.2 谷胱甘肽-S-转移酶活力测定

酶液制备同前。酶活性测定:参照慕立义(1994)方法测定，以谷胱甘肽作底物，经GSTs作用，与还原型谷胱甘肽(GSH) (1.0 mmol·L^-1)反应生成硫醇尿酸衍生物，27 ℃下置于UV-300型分光光度计340 nm处，测定记录5 min内OD变化值。

1.3.3 乙酰胆碱酯酶活力测定

酶液制备方法同上。酶活性测定:参照高希武等(1998)的方法。以Ach为底物，DTNB为显色剂，毒扁豆碱为抑制剂，反应条件为27 ℃，保温15 min，0.1 mmol·L^-1的毒扁豆碱终止反应，在412 nm波长下测定光密度值。

1.3.4 Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶活力测定

酶液制备方法同上。酶活性测定: ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所)。测定吸光度值之前要将比色杯用自来水冲洗多次再用蒸馏水多次冲洗，以防止磷污染。

2 结果与分析 2.1 EFPE-11引起的螨类毒性症状

EFPE-11处理朱砂叶螨后，成螨的中毒症状可分为以下几个阶段(图 1) :

1) 静止期(0~2 h) :在此期间，70%以上的螨处于静止，只有少数螨运动，足呈伸展放松状态，无明显反应;

2) 兴奋期(2~8 h) :在此期间，与对照相比，各处理组处于兴奋期的螨百分数上升，表现为爬行不稳，动作失调，运动不停;

3) 痉挛期(8~12 h) :在此期间，处理组痉挛螨的百分数明显高于对照，表现身体倾斜，运动失调，原地打转，足颤抖，有黑色排泄物;

4) 死亡期(12~24 h) :从12 h后开始，处理组螨身体逐渐收缩至死亡。

EFPE-11处理成螨后，先是静止不动，经过短暂地兴奋后，虫体大量进入痉挛期，经过长达8 h的痉挛期后，进入死亡期，而且产卵量急剧下降，蜕皮大量减少，有黑色排泄物。

2.2 对酶活性的影响 2.2.1 谷胱甘肽-S-转移酶

由图 2可见:用EFPE-11处理朱砂叶螨雌成螨后，体内谷胱甘肽-S-转移酶活性变化明显，处理组的活性均高于对照组，尤其在处理16 h时，药剂强烈诱导激活酶活力，此时活力高达对照组的8.47倍。GSTs活性的增加加速了螨体对药剂的解毒作用。在20 h后，由于EFPE-11中的有毒物质在螨体内的积累，解毒代谢受抑制，因而导致GSTs活性有所下降，同时处理组螨体内GSTs活性的升高可能也是螨体内组织损伤(王荫长，2004)进而导致死亡的原因之一。

2.2.2 乙酰胆碱酯酶

EFPE-11处理朱砂叶螨雌成螨后，AChE活性的变化结果如图 3，0~24 h，处理组螨体内的乙酰胆碱酯酶活性与对照组呈交替变化的趋势。4 h时，处理组酶活性升高，是对照组的1.61倍，4~8 h之间逐渐下降，8 h时与对照组酶活性基本相当，8~16 h活力强度开始回升，尤其到16 h，酶活性高于对照1.93倍，之后大幅度下降，20~24 h，其体内酶活性被抑制，为对照组的70.1%和81%。总体上讲AChE没有明显被抑制，也许不是EFPE-11在螨体内的作用靶标; 相反，它通过某种方式激活了螨的解毒机制，使积累的乙酰胆碱被水解。

2.2.3 Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶

从图 4可见: EFPE-11处理朱砂叶螨雌成螨后，Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶活性与对照组在整个24 h交替变化。4 h时处理组酶活力明显高于对照组，但在8 h时当对照组活力迅速上升时，处理组却急剧下降，仅为对照的15.6%，8 h后酶活性变化幅度大，呈快速上升、下降的急剧变化当中，到24 h时酶活力降到极低，比活力只有0.138，而对照组12 h后呈上升趋势。这说明，Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶有可能为EFPE-11在朱砂叶螨体内的靶标之一，在处理过程中此酶活性有所升高可能是螨体体内发生了一系列生理生化反应，随着作用时间的推移，EFPE-11对Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶的抑制可能是朱砂叶螨导致死亡的重要因素之一。

3 结论与讨论

植物源杀虫剂对害虫的作用机制与常规化学农药差别很大，后者大多数仅作用于害虫的某一生理系统的一个或少数几个靶标，而多数植物性杀虫剂由于活性成分复杂，能够作用于昆虫的多个器官系统，有利于克服害虫抗药性(于连江，2007)。

EFPE-11能引起螨体的快速反应，对雌成螨症状观察可以看出:大戟狼毒对朱砂叶螨作用方式是多方面的，具有触杀、抑制生长发育、抑制繁殖等作用，可能会影响螨的神经系统。进一步的作用机制研究证明:螨体内无论是解毒代谢酶还是靶标酶都产生较大变化，它们之间又相互影响引起朱砂叶螨体内的生理生化代谢。

谷胱甘肽-S-转移酶是螨类体内最活泼解毒酶中的一种，是生物体对外源有毒物质进行代谢的重要共轭酶系之一，它能催化内源性的GSH对底物进行亲核共轭代谢，尤其在许多有机磷杀虫剂的解毒代谢中起重要作用。EFPE-11可以激发解毒酶类的活性，对药剂进行水解、集团转移等降解作用。当它进入试螨体内时，激发谷胱甘肽-S-转移酶的活性，并开始对其进行解毒作用; 但随着时间的推移，其活性受到抵制，会导致毒性物质的积累。

神经系统是目前大多数农药的作用靶标，乙酰胆碱酯酶是生物体内影响神经系统的主要酶，是一类催化酰基胆碱水解的酶类，它主要存在于中枢神经灰质、交感神经节等处(Kondo et al., 1995)，能够迅速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱而保持神经突触传递的正常功能，是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标(任晓霞，2002); EFPE-11对试螨体内的乙酰胆碱酯酶活性有一定的抑制作用。

Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶是细胞膜上的Ca²⁺泵，它可以水解ATP，使细胞内Ca²⁺泵到细胞外，以维持细胞内相对较低的Ca²⁺浓度，细胞兴奋时，胞内Ca²⁺增加，Ca²⁺和CaM结合成Ca²⁺ -CaM复合物，后者激活Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶，将细胞内游离Ca²⁺泵出细胞，并促进游离Ca²⁺转运入内质网和线粒体内贮存，由此降低Ca²⁺浓度。这是维持细胞稳态的重要机制之一，也是细胞功能得以正常发挥的基础(Ross et al., 1983)。EFPE-11对试螨体内Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶的活性在10~20 h被激活，表明螨体细胞在将多余的Ca²⁺泵到细胞外; 但20 h后此酶活性被强烈抑制，其活力仅为0.138 mmol·mg^-1 min^-1，可能会导致螨体细胞内Ca²⁺“超载”，从而使神经末梢内Ca²⁺浓度增高，神经递质释放量增加，导致传导逐渐被阻断。因此Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶被抑制可能是EFPE-11导致朱砂叶螨死亡的主要原因。

综合考虑大戟狼毒活性成分处理朱砂叶螨后，其体内多种酶和症状的变化过程，从中可以推测，Ca²⁺-Mg²⁺ ATP酶活性最后被强烈抑制，可能是EFPE-11引起试螨死亡的主要原因，此外，虽然乙酰胆碱酯酶引起螨的兴奋不是导致死亡的主要原因，但可以看出有一定的关联。大戟狼毒内含有狼毒素、狼毒碱等具有杀虫活性。到目前为止，笔者对大戟狼毒的杀螨活性成分分离还处于初级阶段，药剂对朱砂叶螨作用的活性物质是否是以上分离出的化合物或狼毒素，还需进一步研究。