林果病害是一类重要的生物灾害，危害严重。我国对于林果病害的防治研究，主要采用以栽培措施和化学防治措施为主，虽然取得了一定的防治效果，但林果病害化学防治带来的环境污染等缺陷使其受到了极大限制。生物防治作为一种最有前途的病害防治方法，利用植物内生菌防治植物病害是目前生物防治的重要途径。植物内生菌是能定殖在健康植物组织内，并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物，由于内生菌与病原物一般处于相同的生态环境，因此利用植物内生菌进行植物病害的生物防治，效果会相对稳定和持久，因此，近年来利用内生菌进行植物病害的生物防治研究越来越多(Torsten, 2005; 刘永锋等，2007; 赵达等，2007; 姜莉莉等，2009)。

林果病害的生物防治研究主要停留在林果内生拮抗菌的发现及抗病机制的初步研究。刘晓光等(1999)通过对毛白杨(Populus tomentosa)内生真菌区系种群分析，筛选出优势种螺旋毛壳(Chaetomium spirale)ND35，测试了该菌对杨树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)菌丝的生长和孢子萌发率的影响。结果表明:该菌可降低溃疡病菌菌丝的生长率和孢子的萌发率，同时也对苹果(Malus pumila)轮纹病菌(B. dothidea)、杨树腐烂病菌(Volsa sordida)、板栗(Castanea mollissima)疫病病菌(Cryphonectria parasitica)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)进行了试验广谱性拮抗菌，该菌为毛白杨体内习居的自然内生菌优势种群，而非引进的生防因素，在与寄主长期协同进化的过程中在生理上已彼此适应，因而具有较强的适生性，相对比较稳定，易于在短期内形成种群优势，比引进的外来拮抗菌具有更强的竞争能力。同时研究后认为:毛壳ND35可降低病菌菌丝的生长率和孢子的萌发率，并对小核菌的菌核进行重寄生，从而抑制其萌发，毛壳ND35的菌丝还产生吸器、附着枝等结构对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等病菌的菌丝进行重寄生，在显微镜下可观察到病菌的菌丝被缠绕、穿透、断裂等现象; 高克祥等(2001)应用来自于杨树树干上分离的哈茨木霉(Trichoderma harazianum)T88菌株和从苹果腐烂病病疤上分离纯化获得的深绿木霉(T.atroviride)T95通过培养皿对峙培养和载片对峙培养，研究2菌株对杨树溃疡病菌的拮抗作用和拮抗机制，认为2种木霉菌产生的非挥发性代谢物质可以强烈抑制病原菌的生长、明显降低其菌丝干质量、具有热稳定性。在光学显微镜和扫描电镜下观察到木霉菌的菌丝在病原菌的菌丝上平行或波浪式生长，并在其上产生钩状分枝、吸器或附着胞吸附于病原菌的菌丝上，或穿透病原菌的菌丝生长，或使病原菌的菌丝细胞原生质浓缩和菌丝断裂; 何邦令等(2006)也应用内生木霉菌和毛壳菌对板栗疫病病菌的拮抗作用进行了探讨; 金静等(2004)通过对杨树树皮微生物区系周年变动规律的研究，筛选出了多种对溃疡病菌有抑制作用的微生物。笔者从石榴(punica granatum)果实内筛选了一株拮抗效果好的内生细菌，并对拮抗菌的分类地位、生理生化特性及抗病特性等进行了初步研究。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 拮抗菌株

来自石榴内果皮。

1.1.2 供试菌株

选择目前发生严重的几种林果病原菌作为参试菌株:杨树溃疡病菌, 杨树腐烂病菌，石榴枝干干腐病菌(B. dothidea)，石榴果实黑斑病菌(B. parva)，石榴枝干疮痂病菌(B. dothidea)，石榴果实干腐病(Zythia versoniana)，苹果轮纹病，枣缩果病菌(B. dothidea)

1.2 拮抗菌分类地位的鉴定 1.2.1 菌体形态观察学及生理生化指标测定

取培养18 h的拮抗细菌单菌落，涂于载玻片上进行负染，电镜下观察菌体的形态、大小、鞭毛特征; 菌体的菌落特征及生理生化指标测定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)以及《植病研究方法》(方中达，1979)。菌体菌落形态主要观察单菌落形状、大小、颜色、表面、边缘、隆起特征、透明度等。生理生化特征主要是测定拮抗菌的需氧特征、NaCl耐受度、柠檬酸盐利用、丙二酸盐利用、接触酶、V-P试验、甲基红试验、明胶液化、H₂S产生、硝酸盐还原、糖发酵试验、醇发酵试验等13项生理生化指标。

1.2.2 拮抗菌16S rDNA序列的测定

1) 拮抗菌总基因组DNA的提取  参照天根公司的试剂盒(DP302)方法提取菌体总DNA。

2) 引物设计  菌株16S rDNA的PCR扩增采用通用引物参照胡宝兰等(2006))正向引物(pf):AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 反向引物(pf):ACGGCTACCTTGTTACGACT。

3) 16S rDNA PCR扩增  设置25 μL反应体系为10×PCR buffer 2.5 μL, ，dNTP 0.5 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，Taq酶0.5 μL，MgCl₂1.5 μL，DNA 2.0 μL，ddH₂O 13.0 μL; PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，重复步骤上述30次，72 ℃延伸5 min将获得PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中取5 μL电泳，观察目标片段的大小。

4) PCR产物的纯化回收、连接、克隆和测序  扩增后的目标片段按天根公司的试剂盒说明进行纯化回收，按pMD18-T载体试剂盒说明进行连接操作，然后用JM109感受态细胞进行转化，通过蓝白斑筛选得到重组质粒，将重组质粒菌液送上海博尚生物技术有限公司测序。

5) 拮抗菌菌株的序列分析和鉴定  将测定的菌株序列分别在NCBI上进行Blast比对，并选择Genbank中同源性较高的菌株序列与参试的拮抗菌株序列进行比对，确定菌株的分类地位。

1.3 拮抗菌抗菌特性的初步研究 1.3.1 拮抗菌对几种林果病原菌的抑制作用测定

采用平板对峙培养方法。选取培养5天生长一致的上述病原菌菌落，用解剖针挑取大小一致的病原菌菌饼(菌丝朝下)接种在培养皿一侧，并设置无拮抗菌的病原菌为对照。25 ℃恒温培养24~36 h，取出上述对峙培养平板，然后在培养皿的另一侧接种等量菌饼大小的拮抗菌，在25 ℃继续培养24~36 h后，观察是否出现抑菌圈，并测量抑菌圈的大小，每种处理重复5次。抑制效果用被抑制率表示，被抑制率=(单独培养菌落直径-菌落趋向直径)/单独培养菌落直径×100%，利用DPS3.01进行方差分析比较拮抗菌的拮抗效果。

1.3.2 拮抗菌对不同林果病原菌菌丝形态的影响

在上述病菌与拮抗菌对峙培养的基础上，挑取培养5天的抑菌圈边缘的病原菌菌丝，在光学显微镜下观察病原菌的菌丝形态及变化，初步探讨拮抗菌的拮抗机制。

2 结果与分析 2.1 菌体形态及生理生化指标测定 2.1.1 菌体形态观察

经电镜观察并测定拮抗细菌个体大小:该菌体形状为杆状，平均大小为1.18 μm×0.37 μm，鞭毛特征不明显。为革兰氏阳性菌(表 1)。

2.1.2 拮抗菌在PDA平板上的菌落特征

单菌落为圆形，乳白色、奶油状、不透明、中央隆起、光滑、边缘完整、易乳化。

2.1.3 拮抗菌的生理生化特性

通过生理生化指标的测定，菌体为好氧菌，厌氧条件下生长微弱; 在含有7%和10%NaCl的液体培养基生长良好; 可利用丙二酸盐及柠檬酸盐做碳源; 可利用无机氮源如硝酸盐; 菌株过氧化氢试验为阳性反应; 产酸，不产气; 可使明胶液化; 产生硫化氢; 甲基红试验为黄色，呈阴性反应; V-P试验为红色，为阳性反应。综合所测定的生理生化指标，结果见表 1。

2.2 拮抗菌16SrDNA序列的测定

将提取的经电泳为单一条带的细菌基因组总DNA，经PCR扩增，拮抗菌16S rDNA在1 500~1 600 bp之间出现单一的条带，结果见图 1。

2.2.1 测序结果

将测序结果提交到Genbank中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，其登陆号为GQ871508，应用BLAST软件比对拮抗细菌序列与Genbank中的其它基因组序列，发现其基因序列与Genbank中EU627167(Bacillus subtilis)和EF443161(Bacillus subtilis)等同源性达到99%。

2.2.2 拮抗菌分类地位的鉴定

结合拮抗菌的形态、生理生化和分子特性，可以判定该拮抗细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.2 拮抗菌抗菌特性的初步研究 2.2.1 拮抗菌对几种林果病原菌的抑制作用测定

测定结果见表 2。从表 2可以看出，拮抗菌对几种病原菌均有不同程度的抑制作用，其中对杨树溃疡病菌、杨树腐烂病菌、石榴疮痂病菌具有最好的抑制作用，对其他病菌的抑制作用也较好，而对枣缩果病菌的抑制效果较差。同时，拮抗菌与病原菌之间出现明显的抑菌圈，没有出现拮抗菌和病原菌混生的情况，说明拮抗菌分泌了某些物质抑制了病原菌的生长。

2.2.2 拮抗菌对林果病原微生物菌丝形态的影响

通过在光学显微镜下观察几种病原菌与拮抗菌互作后菌丝的生长和形态特征，结果见图 2。

从图 2可以看出，抑菌圈处的菌丝体形态较正常菌丝相比，发生了显著的变化。由B.dothidea, B. parva和Z. versoniana引起的林果病菌菌丝变化特征相同，主要表现为菌丝分支增多，扭曲，部分菌丝细胞出现断裂和原生质浓缩现象，菌丝顶端和中部细胞膨大成球形或椭圆形，随着时间的延长菌丝畸变情况更加严重，有的菌丝成念珠状，有的顶端膨大明显聚集成簇并且颜色加深，然后细胞进一步膨大，细胞透明度增加，最后菌丝变成空泡。而由V. sordida引起的杨树腐烂病菌菌丝形态表现为菌丝细弱，分支减少，菌丝顶端不明显，不膨大成球形，也不形成念珠状，有的菌丝消解并难以辨认。

3 结论与讨论 3.1 结论

通过对拮抗菌形态学、生理生化及分子特性的研究表明:该拮抗菌为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)，菌体呈杆状，平均大小为1.03 μm×0.37 μm，鞭毛特征不明显，为革兰氏阳性菌; PDA培养基上单菌落为圆形、乳白色、奶油状、不透明、中央隆起、光滑、边缘完整、易乳化; 13项生理生化指标的测定表明:该拮抗菌耐盐性比较强、好氧性、接触酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、丙二酸盐利用、明胶水解、V-P、糖发酵试验均为阳性; 甲基红试验醇发酵试验为阴性。

拮抗菌对几种林果病害病原菌的抑制作用测定表明:拮抗菌对病原菌具有不同程度的抑制作用，其中对杨树溃疡病菌、杨树溃疡病菌和石榴疮痂病菌的抑制作用最为明显，而对其他几种病菌也有不同程度的抑制作用，说明该菌抗菌效果好; 拮抗菌对由B. dothidea, B. parva和Z. versoniana引起的林果病菌菌丝形态表现为菌丝分支增多，扭曲，部分菌丝细胞出现断裂和原生质浓缩现象，菌丝顶端和中部细胞膨大成球形或椭圆形，有的成念珠状，有的顶端膨大明显聚集成簇并且颜色加深，且细胞继续膨大，透明度增加，最后菌丝变成空泡。而由V. sordida引起的杨树腐烂病菌菌丝形态表现为菌丝细弱，分支减少，菌丝顶端不明显，不膨大成球形，也不形成念珠状，有的菌丝消解并难以辨认，说明拮抗菌对不同病原菌的抗性机制是不同的。

3.2 讨论

本研究采用先接种病原菌24 h后等病原菌生长到一定程度后才接种拮抗细菌进行对峙培养，其主要的原因是拮抗菌生长非常迅速，如果两者同时接种试验，待测的几种病原菌几乎不生长。本研究采用不同步接种方法，观察病菌生长到一定程度后该生防细菌的抗菌作用，作用效果良好。

本研究仅做了拮抗菌对目前发生严重的几种林果病害病原菌进行了测定，其对其他病原菌的拮抗效果尚需要继续测定。

枯草芽孢杆菌作为一种分布广泛的内生细菌，其生防潜力巨大，本研究分离获得的枯草芽孢杆菌，能够产生明显的抑菌圈，说明该拮抗菌内一定存在着某些生物活性物质，其抗菌活性物质的成分、性质、结构和功能鉴定目前正在进行中。