文冠果(Xanthoceras sorbifolia)为无患子科(Sapindaceae)文冠果属(Xanthoceras)植物，是我国特有的珍稀木本油料和药用植物, 可治疗小儿遗尿症(特格喜等，1997)、心脏病、血管病等，具有抗癌(王红斗，1998)、抗艾滋病(李在留等，2007; Ma et al., 2000; 2004)活性。种子可用于生产柴油、食用油和高级润滑油(朱丹等，1997)，是国家重点生物燃油树种，种仁含油率为55%~67%。目前，已有文冠果体细胞胚(顾玉红等，2004)及其发生过程中钙的超微细胞化学定位(顾玉红等，2008)的研究，为更好地利用它，还需建立稳定的悬浮培养细胞体系并掌握细胞生长特性。已有研究表明:水翁(Cleistocalyx)(周英彪等，2007)、西洋参(Panax ginseng)(闫静辉等，2005)、桑树(Moms alba)(李勇等，2007)及红豆杉(Taxus Chinensis)(刘华，2002)悬浮细胞系的建立及其细胞生长特性的研究对快繁及原生质体制备有重要作用。本试验以文冠果种胚为外植体诱导获得愈伤组织，对初始接种量、激素浓度进行筛选，建立悬浮培养体系，并对该体系的细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞活力等进行研究，旨在获得稳定的悬浮培养体系并掌握细胞生长特性，为原生质体的制备、细胞分裂研究等奠定基础，为开展大规模培养文冠果细胞获得药用成分和油用资源服务。

1 材料与方法 1.1 试验材料

4 ℃下干燥贮藏的、成熟的文冠果种子。

1.2 试验方法 1.2.1 接种与继代培养的方法

将洗净的种子在超净台上用有效氯浓度为4%~5%的NaClO₃溶液消毒10 min，无菌水漂洗5次; 再用75%的酒精溶液消毒1 min，无菌水漂洗3次后用无菌水浸泡过夜。在超净台里剥去种皮，将种胚切成0.5 cm³的碎块，接种到B₅+2.0 mg·L^-1 2, 4-D + 20.0 g·L^-1蔗糖+ 5.5 g·L^-1琼脂的培养基(pH5.8)上，培养温度为(25±1)℃，暗培养，此为初代培养。将初代培养15天获得的愈伤组织(图 1)转接到B₅ + 1.0 mg·L^-1 2, 4-D + 1.0 mg·L^-1 NAA+20.0 g·L^-1蔗糖+5.5 g·L^-1琼脂的培养基(pH5.8)上进行第1次继代培养，培养温度同上，弱光。15天后进行第2次继代培养，培养条件同第1次继代培养，培养15天后获得胚性愈伤组织(图 2)。

1.2.2 建立文冠果细胞悬浮培养体系的方法

文冠果细胞悬浮培养的初始接种量的筛选:分别称取疏松的胚性愈伤组织1.0, 2.0, 3.0, 4.0 g，接种到装有40 mL液体培养基(B₅+0.5 mg·L^-1 2, 4-D+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+20.0 g·L^-1蔗糖，pH5.8)的100 mL三角瓶中，每处理接种15瓶。培养18天后测定悬浮液中细胞的鲜质量与干质量，按照以下公式计算增长率，并进行方差分析。观察悬浮细胞的生长状态。

增长率(%)=[ (培养18天后的细胞质量-初始接种量)/初始接种量]×100%。

文冠果细胞悬浮培养的外源激素浓度的筛选:称取胚性愈伤组织2.0 g，接种到装有40 mL液体培养基(pH5.8)的100 mL三角瓶中。以B₅为基本培养基，加20.0 g·L^-1蔗糖，2, 4-D、6-BA, NAA的配比见表 1。每处理接种15瓶，培养18天后测细胞的鲜质量与干质量，计算增长量(培养18天后的细胞克数－初始接种的细胞克数)，进行方差分析。观察悬浮细胞的生长状态。

1.2.3 文冠果悬浮细胞生长特性的研究方法

将2.0 g颜色鲜黄、质地疏松、分散性高的胚性愈伤组织接种到装有40 mL培养基(B₅+0.5 mg·L^-1 2, 4-D + 0.5 mg·L^-1 NAA + 0.5 mg·L^-1 6-BA + 20.0 g·L^-1蔗糖，pH5.8)的100 mL三角瓶内，DZ-900型旋转摇床上[80 rpm，(25±1)℃]光照振荡培养，3天后用80目细胞筛滤除大的细胞团块，18天继代1次，3~4次后形成主要由单细胞和小型细胞团组成的细胞悬浮系(图 3)，进行细胞生长特性的研究。

细胞生长曲线的测定:从培养的第2天起，每2天取1次样直到18天，每个样本5瓶，3次重复，称重法测细胞鲜质量，计算鲜质量增长量(每次取样的细胞克数－初始接种克数)，以培养时间为横坐标，增长量为纵坐标，绘制生长曲线。

细胞分裂指数的测定:从培养的第2天起，每2天取1次样直到18天，在载玻片上滴加细胞悬浮液和1%的醋酸洋红染液各1滴，盖上盖玻片，在酒精灯上微热则细胞核被染上色而细胞质无色，于OLYMPUS CX21型显微镜下观察细胞分裂情况并照相，观察1 000个以上细胞，记录分裂期细胞个数，计算细胞分裂指数(分裂期细胞数/细胞总数×100%)。

细胞活力的测定:接种第1~4天每天取样，之后每2天取1次样直到18天。采用TTC法(Fischer et al., 1995)。将悬浮细胞过滤后，每试管加悬浮细胞350 mg(鲜质量)、0.4%的TTC溶液2.5 mL、pH7.0的磷酸缓冲液2.5 mL，混匀，25 ℃避光处理16~19 h，去上清液，加5 mL蒸馏水洗涤细胞，重复3次。加95%的乙醇5 mL，60 ℃下水浴30 min后室温下至细胞无色。取上清液，用UV-2102C型分光光度计在485 nm下测吸光值，初始培养基按以上程序操作用以调零。吸光值越大，细胞的活力越强(Tsuruoka et al., 1996)。

2 结果与分析 2.1 文冠果悬浮细胞系的建立 2.1.1 初始接种量对文冠果悬浮细胞培养的影响

初始接种量对文冠果悬浮细胞培养的影响见表 2。从细胞增长率看，初始接种量1.0和2.0 g处理之间的差异不显著，但均极显著高于3.0, 4.0 g的处理。从生长状态来看，初始接种量为2.0 g的细胞团小且数量多，分散性好，悬浮液较为清澈; 初始接种量为3.0, 4.0 g的细胞团数量较少，细胞次生代谢产物和细胞碎片较多致使悬浮液浑浊。因此，选定2.0 g为文冠果悬浮细胞培养的最适初始接种量。

2.1.2 外源激素浓度对文冠果悬浮细胞培养的影响

外源激素浓度对文冠果悬浮细胞培养的影响见表 3。从增长量看，由大到小依次为K2, K1, K4, K3处理，各处理间的鲜质量增长量均呈极显著差异，处理K4和K3的干质量增长量极显著高于K2和K1。从生长状态来看，处理K2的生长好、细胞团小而多、悬浮液较清。综合考虑，选2, 4-D, 6-BA, NAA均为0.5 mg·L^-1的处理K2为文冠果悬浮细胞培养的最适激素浓度。

2.2 文冠果悬浮培养细胞生长特性的研究 2.2.1 文冠果悬浮培养细胞的生长曲线

由图 4可知:文冠果悬浮培养细胞的生长曲线呈“S”型，即增长量呈先上升后下降的趋势。接种第1~4天为延迟生长期，增长量很小; 第5~14天为快速生长期，增长量急剧增加; 第14天增长量最大，其值为2.020 4 g，第15~18天为生长减慢期，增长量下降。

2.2.2 文冠果悬浮培养细胞分裂指数的变化

文冠果胚性悬浮培养细胞的分裂情况见图 5~7，其细胞的分裂指数随培养时间的变化如图 8所示，呈先上升后下降的趋势。接种第1~2天未见细胞分裂，之后细胞分裂指数急剧上升，并在第10天达到最大，其值为5.7%，第11~14天细胞分裂指数急剧下降，第15~18天细胞分裂指数缓慢下降。

2.2.3 文冠果悬浮培养细胞活力的变化

文冠果悬浮培养细胞活力的变化如图 9所示，呈先上升后下降的趋势。接种第1~3天的细胞活力急剧上升，第3天达到最大值，第4~18天细胞活力逐渐下降。

3 结论与讨论

本研究表明: 40 mL液体培养基中加2.0 g文冠果愈伤组织为宜。这与50 mL培养液中加入2.0 g皂质芦荟(Aloe saponaria)愈伤组织为宜的结果相近(周晓鹿等，2008)，说明植物细胞在液体培养基中生长需要一定的细胞密度，从而形成细胞生长所需要的生理环境。细胞密度过低时，细胞生长量低; 细胞密度过大，会因营养缺乏而使细胞过早衰亡。

本研究表明:文冠果悬浮培养细胞的生长曲线呈“S”型，即增长量呈先上升后下降的趋势，第15~18天为生长减慢期，增长量下降，认为在进行细胞增殖时的继代周期以15~18天为宜。这与水翁(周英彪等，2007)、西洋参(闫静辉等，2005)、桑树(李勇等，2007)等悬浮细胞生长曲线的趋势一致。说明刚接种的细胞因需适应新的培养基环境导致增长量很小，适应后增长量迅速增加，培养后期则主要因营养缺乏而使细胞增长量下降。文冠果悬浮培养细胞的分裂指数呈先上升后下降的趋势，并在第10天达到最大，认为在进行细胞分裂方面的研究时以接种第10天左右取材为宜。这与桑树悬浮细胞在接种第1天未见细胞分裂，细胞分裂指数在接种第10天达到最大值5.19%(李勇等，2007)的结果相近，而与红豆杉悬浮细胞接种第1~4天未见细胞分裂，细胞分裂指数在接种第8天达到最大值3.58%(刘华，2002)有异，由此可见:虽然这3个物种的变化趋势一致，但在时间上2种被子植物与裸子植物的差别较大。文冠果悬浮培养细胞的活力呈先上升后下降的趋势，并在接种第3天达到最大，认为在进行原生质体制备研究时以接种第3天取材为宜。这与桑树(李勇等，2007)、红豆杉(刘华，2002)等的结果一致，即生长延迟期细胞活力最高，快速生长期细胞活力降低。

综合分析表明：文冠果悬浮细胞在接种后有生长延迟期需要适应新的培养基，此时细胞活力最大，增长量最小，细胞分裂指数最低; 之后细胞分裂指数剧增，细胞活力下降，增长量急剧增加，细胞进入快速生长期，且细胞分裂指数的高峰比细胞增长量的高峰早，说明增长量的增加主要来自于细胞的分裂即细胞个数的增加，而不是细胞体积的增长。