枇杷(Eriobotrya japonica)为原产我国的蔷薇科枇杷属(Eriobotrya)常绿果树，喜温暖湿润气候。枇杷品种根据生态类型可分为温带型和热带型，温带型品种耐寒性较强，适宜在我国北亚热带和部分温暖有霜雪地带栽培，如江苏、浙江、湖北和安徽等地; 热带型品种耐寒性较差，适于南亚热带及热带边缘地区栽培，如福建和广东等省份(吴锦程等，2009)。低温胁迫是热带型枇杷品种生长的关键限制性因子，近年我国南方山地枇杷产区都有不同程度的冻害发生。‘早钟6号’枇杷(E. japonica cv. ‘Zaozhong No.6’)是我国栽培面积最大的早熟枇杷品种，该品种幼果的生长发育期处在一年中气温最低的12月到次年1月, 幼果易遭受冻害。据不完全统计, 2004年仅福建省‘早钟6号’枇杷种植面积就达1.98万hm², 占枇杷栽培总面积的64.51%, 福建以早熟品种‘早钟6号’枇杷冻害发生最为严重，2003—2005年福建枇杷生产连续3年因遭受霜冻减产30%以上，造成严重的经济损失，枇杷幼果受冻问题十分突出(邱武凌，2000; 谢钟琛等，2006; 张夏萍等，2007)。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体中一种重要的氧化还原信号分子和毒性分子，广泛存在于植物组织中，能诱导相关防御基因的表达，并在逆境中作为一种抗氧化剂起作用，参与生物及非生物胁迫下植物适应性的提高(赵志光等，2002)。吴雪霞等(2009)研究发现:外源NO处理可提高盐胁迫下番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗叶片保护酶活性和抗氧化剂含量, 降低ROS水平, 缓解膜脂过氧化作用，提高植株抵御盐害的能力。NO对盐胁迫下小麦(Triticum aestivum)的氧化损伤也具有保护作用，王宪叶等(2004)研究发现外源NO预处理小麦可明显缓解渗透胁迫造成的小麦膜脂过氧化。硝普钠(SNP)可被植物细胞吸收并降解释放一氧化氮(Belignim et al., 1999)，因此不少研究采用SNP进行外源处理来探讨NO的作用效应。徐洪雷等(2007)报道适宜质量浓度的SNP处理对过氧化产物丙二醛的积累起抑制作用，提高幼苗体内过氧化物酶活性，从而增强黄瓜(Cucumis sativus)幼苗对低温胁迫的适应性。马向丽等(2005)采用不同质量浓度的SNP处理低温胁迫下一年生黑麦草(Lolium perenne)幼苗，发现外源NO能降低质膜相对透性，促进脯氨酸积累，增强超氧化物歧化酶(SOD)等保护酶活性，提高黑麦草的抗寒性。作为信号分子，NO在植物抗逆性中的作用越来越受到重视。外源NO对低温胁迫下枇杷幼果氧化损伤调节作用的研究未见报道，本试验采用外源NO对低温胁迫下枇杷幼果抗氧化物质和保护酶活性的影响，旨在为外源NO对枇杷幼果抗寒性影响的生理机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

以3年生‘早钟6号’枇杷容器苗为试材(福建省莆田市果树研究所提供)。选取长势一致、无病虫害与损伤、生长正常、花后60天的枇杷容器苗(已疏果)，分别采用0.2, 0.5和1.0 mmol·L^-1的SNP溶液100.0 mL均匀喷施于叶面和幼果，以无低温胁迫喷清水处理为对照1 (CK1);以-3 ℃低温胁迫加喷清水处理为对照2 (CK2);以-3 ℃低温胁迫与0.2 mmol·L^-1的SNP处理为处理1(T1);以-3 ℃低温胁迫与0.5 mmol·L^-1的SNP处理为处理2(T2);以-3 ℃低温胁迫与1.0 mmol·L^-1的SNP处理为处理3(T3);每个处理10株，3次重复，每个重复共取20个幼果组成混合样。将经SNP处理和CK2容器苗置于人工气候室(相对湿度为70%，光照时间为6: 30—18: 30，光照强度为2 000 lx)的-3 ℃低温下处理6 h，后于室温下平衡10 h，迅速取下幼果经液氮速冻后保存于-70 ℃低温冰箱，待测相关指标。

1.2 试验方法

丙二醛(MDA)和还原型抗坏血酸(AsA)含量测定参照陈建勋等(2002)的方法稍加修改。脯氨酸(Pro)含量测定采用磺基水杨酸法略有改动(Fadzilla et al., 1997)。过氧化氢(H₂O₂)含量测定参照邹琦(2000)的方法。氧化型抗坏血酸(DHA)含量测定采用2, 4-二硝基苯肼比色法，测出总抗坏血酸含量减去AsA即得DHA含量(陈沁等，2000); 还原型谷胱甘肽(GSH)测定参照Ellman (1959)的DTNB显色法稍加修改; GSSG含量的测定采用GSSG检测试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)。

过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定参照陈建勋等(2002)的方法，以1 min内OD_{240 nm}变化0.01定义为1个CAT酶活力单位，以1 min内OD_{470 nm}变化0.01定义为1个POD酶活力单位，以抑制NBT光氧化还原50%所需的酶量为1个SOD酶活单位(U)，以1 min内OD_{290 nm}变化0.01定义为1个APX酶活性单位。

1.3 数据分析

试验所得数据的相关性分析和显著性检验采用Microsoft Excel和SPSS统计软件进行相关分析并作图, 图中数据均为3次重复试验的平均值。

2 结果与分析 2.1 NO对低温胁迫下枇杷幼果MDA含量的影响

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终产物，能与膜结构上的蛋白质和酶结合、交联而使之失活，破坏膜的结构。从图 1中可以看出: CK2幼果MDA含量明显高于对照CK1和SNP处理，以1.0 mmol·L^-1 SNP处理的幼果MDA含量最低，比CK1降低39.8%，比CK2降低97.95%。CK1和CK2与1.0 mmol·L^-1 SNP处理的幼果MDA含量之间的差异达显著性水平(P < 0.05)，说明低温胁迫导致幼果细胞内过氧化产物MDA积累的增加，外源NO处理可抑制幼果MDA的积累，在一定程度上缓解低温对膜的伤害。

2.2 NO对低温胁迫下枇杷幼果Pro含量的影响

植物体内游离脯氨酸对原生质具有保护作用，可作为植物抗寒性测定的指标。由图 2可见: SNP处理的幼果脯氨酸含量均高于CK1和CK2，其中0.2, 0.5和1.0 mmol·L^-1SNP处理的幼果脯氨酸含量分别比CK2高42.58%, 19.39%和42.58%，差异达显著性水平(P < 0.05)。表明外源NO处理对低温胁迫下枇杷幼果游离脯氨酸积累量的增加具有促进作用。

2.3 NO对低温胁迫下枇杷幼果H₂O₂含量的影响

低温等逆境胁迫对植物的伤害大多与植物体内的活性氧代谢失调有关，过量的H₂O₂积累会导致细胞伤害甚至死亡的发生。由图 3可见:经不同质量浓度SNP处理的幼果H₂O₂含量均低于CK1和CK2，幼果H₂O₂含量从高到低依次为CK2＞CK1＞T1＞T3＞T2，其中0.5 mmol·L^-1 SNP处理的幼果H₂O₂含量最低，但CK1与SNP处理的幼果H₂O₂含量差异不显著(P>0.05)。CK2幼果的H₂O₂含量分别比CK1, T1, T2和T3高25.90%, 25.94%, 29.98%和26.99%，差异达显著水平(P＜0.05)。表明适当外源NO处理可减少低温胁迫下枇杷幼果H₂O₂的累积，但并非SNP处理浓度越高效果越理想。

2.4 NO对低温胁迫枇杷幼果GSH和GSSG含量及GSH/GSSG的影响

在AsA-GSH循环中，GSH是一种重要的非酶抗氧化剂，GSH在清除活性氧的同时自身被氧化生成GSSG，GSH/GSSG是反映细胞内GSH活性的指标。由图 4可见: CK1和SNP处理的幼果GSH含量均高于CK2，分别比CK2高35.77%, 22.76%, 55.28%和41.46%，差异达显著水平(P＜0.05)，以0.5 mmol·L^-1SNP处理幼果的GSH含量最高。CK2幼果的GSSG含量均高于CK1和SNP处理，CK1与0.2 mmol·L^-1SNP处理以及0.5与1.0 mmol·L^-1SNP处理之间幼果的GSSG含量差异并不明显(P＞0.05)，1.0 mmol·L^-1SNP处理的幼果GSSG含量最低(图 5)。CK2幼果的GSH/GSSG显著低于CK1和SNP处理(P＜0.05)，0.5 mmol·L^-1SNP处理的幼果GSH/GSSG比值最高(图 6)。说明低温胁迫抑制细胞内GSH的再生，0.5 mmol·L^-1SNP处理可促进幼果抗氧化剂GSH的积累，显著提高细胞内GSH/GSSG比值，增强枇杷幼果在低温胁迫下的抗氧化能力。

2.5 NO对低温胁迫下枇杷幼果AsA和DHA含量及AsA/DHA的影响

AsA是植物细胞内有效的抗氧化剂，在维持活性氧代谢平衡中起重要作用，AsA/DHA比值是衡量AsA抗氧化活性的重要指标，AsA活性较高则AsA/DHA的比值较高。图 7可知: 0.5 mmol·L^-1SNP处理的幼果AsA含量最高，而CK2幼果最低。CK1幼果的AsA含量与0.2和1.0 mmol·L^-1SNP处理差异不显著(P>0.05)，CK1和SNP处理的幼果AsA含量分别比CK2高26.98%, 20.63%, 50.79%和23.81%。而CK2幼果的DHA含量却分别比CK1和SNP处理高34.43%, 28.13%, 38.98%和49.09%，但CK1和SNP处理的幼果DHA含量差异小(图 8)，SNP处理浓度的增加幼果DHA含量趋于减少。CK2幼果的AsA/DHA显著低于CK1和SNP处理(P＜0.05)，以0.5 mmol·L^-1SNP处理幼果的AsA/DHA比值最高(图 9)。

2.6 NO对低温胁迫下枇杷幼果CAT和POD活性的影响

CAT和POD是细胞内重要的H₂O₂清除酶。由图 10和11可知:低温胁迫对幼果CAT和POD活性起抑制作用，但对CAT活性的抑制作用相对较强。SNP处理能显著提高低温胁迫下幼果CAT活性，与CK2相比分别提高34.14%, 45.38%和17.35%，差异达显著性水平(P < 0.05)，以0.5 mmol·L^-1SNP处理效果最明显。0.2和0.5 mmol·L^-1SNP处理的幼果POD活性分别比CK2高34.62%和41.62%，而1.0 mmol·L^-1SNP处理的幼果POD活性与CK2差异不大(P>0.05)。SNP处理浓度过高可能对提高低温胁迫下幼果POD活性不利; 采用适当的SNP处理可在一定程度上提高CAT和POD保护酶活性以缓解低温对幼果的伤害。

2.7 NO对低温胁迫下枇杷幼果SOD活性的影响

SOD是清除超氧阴离子自由基的抗氧化酶。由图 12可知:低温胁迫对幼果SOD活性具有抑制作用，低温胁迫下经不同浓度SNP处理的幼果SOD活性均高于CK1和CK2，SNP处理的幼果SOD活性分别比CK2增加21.4%, 27.58%和39.3%，差异达显著水平(P < 0.05)，而0.2 mmol·L^-1 SNP处理与CK1之间显著性不显著(P>0.05)。随SNP处理浓度的增加，幼果SOD活性呈上升趋势，0.5和1.0 mmol·L^-1 SNP处理对提高低温胁迫下枇杷幼果SOD活性效果相对较为明显。

2.8 NO对低温胁迫下枇杷幼果APX活性的影响

APX以AsA为电子供体可直接清除H₂O₂。由图 13可知:经SNP处理的幼果APX酶活性大小依次表现为T2＞T1＞T3，CK1和CK2幼果的APX活性均低于SNP各处理，0.2, 0.5和1.0 mmol·L^-1SNP处理的幼果APX活性分别比CK2上升51.04%, 43.40%和30.21%，差异均达显著性水平(P < 0.05)，CK1幼果的APX活性高于CK2。表明低温胁迫对枇杷幼果APX活性具有抑制作用，外源NO处理可提高低温胁迫下幼果的APX活性。

3 结论与讨论

低温胁迫可引发或加剧细胞的膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的主要产物之一，其含量变化是衡量膜系统受损害程度的重要标志之一，植物抗寒性与MDA含量呈负相关(刘祖祺等，1994)。刘建新等(2008)研究认为外源NO处理能有效降低盐胁迫下多年生黑麦草幼苗根的丙二醛含量，缓解盐胁迫对黑麦草幼苗的膜脂过氧化损伤。本试验中，在低温胁迫下枇杷幼果细胞内MDA积累增加，引起膜脂过氧化导致冷伤害; 而外源NO处理的幼果细胞内MDA产生量减少，表明其膜脂过氧化程度降低，外源NO处理缓解低温胁迫引起的膜脂过氧化伤害。

脯氨酸(Pro)是物体内有效的渗透调节物质，可以调节细胞的渗透势，提高体内抗氧化酶的活性和维持生物大分子的结构与功能，植物抗寒性与Pro含量呈正相关(cnôté et al., 1989; Vranová et al., 2002;张圣平等，2005)。相关研究证实Pro对活性氧具有清除作用，认为植物体内Pro的积累可能是抗氧化胁迫的一种反应(Smirnoff，1993; 蒋明义等，1997)。张玲玲等(2007)研究外源NO对经NaCl处理的秋茄(Kandelia candel)幼苗叶片中抗氧化系统的调节效应，发现SNP处理促进叶片中脯氨酸含量的上升，使秋茄更好地适应盐生环境。本研究中，外源NO处理的幼果脯氨酸含量均高于CK1和CK2，CK2幼果脯氨酸含量高于CK1，表明低温胁迫刺激体内游离脯氨酸的产生机制; 外源NO处理促进幼果脯氨酸的积累，增强枇杷的抗寒性。

植物在逆境下或衰老时，由于体内H₂O₂发生过量累积，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。外源NO处理可降低低温胁迫下枇杷幼果H₂O₂的含量，这可能与外源NO可直接清除H₂O₂或通过提高幼果抗氧化物含量和抗氧化酶类活性有关，从而减轻细胞受低温胁迫的损伤。

在低温逆境中，CAT, POD, SOD, APX是细胞内源活性氧清除剂，SOD主要功能是清除氧自由基并产生H₂O₂，而H₂O₂通过POD, CAT和APX得以清除，维持活性氧代谢平衡，膜系统得到保护，消除或减轻逆境胁迫的伤害(Vranová et al., 2002)。刘开力等(2005)报道外源NO可通过提高水稻(Oryza sativa)幼苗根组织的抗氧化能力来缓解盐胁迫下的氧化损伤。王榕楷等(2001)研究草坪草的耐寒性与SOD活性的关系，发现SOD活性的下降与低温对草坪草的伤害密切相关。马向丽等(2005)研究证实外源NO处理能显著提高SOD, CAT和POD 3者的活性，从而增强黑麦草的抗冷性。本研究表明: SNP处理可提高枇杷幼果SOD, POD, CAT和APX活性，增强低温胁迫下清除活性氧的能力，缓解低温对幼果的伤害。

外源NO处理使幼果的SOD, POD, CAT和APX保护酶活性上升与MDA含量的下降密切相关，一方面由于SOD, POD, CAT和APX保护酶活性上升，清除有害自由基，MDA的生成减少，膜系统受到保护; 另一方面，MDA的减少可能SOD, POD, CAT和APX的活性上升，增强膜系统保护酶的功能，两方面相辅相成; 同时SOD, POD, CAT和APX在低温胁迫过程中可能存在相互协调的关系。依据低温处理后幼果解剖初步观察的结果，CK2幼果中胚完全变褐、果肉部分变褐，褐变程度最重; 0.2和1.0 mmol·L^-1SNP处理的幼果胚部分变褐至完全变褐、果肉正常，褐变程度较CK2轻; 0.5 mmol·L^-1SNP处理的幼果胚轻微变褐、果肉正常，褐变程度最轻; 不同处理之间幼果抗氧化能力相关生理指标的差异与形态解剖学观察的结果相一致。说明外源NO处理对枇杷幼果SOD, POD, CAT和APX等抗氧化酶活性以及GSH和AsA等非酶抗氧化剂含量具有明显的调节作用，有利于提高枇杷幼果的抗寒性，0.5 mmol·L^-1 SNP处理的效果较为理想。