连翘(Forsythia suspensa)为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)落叶灌木(王瑞华，2007)，我国产于河北、山西、陕西、山东、安徽西部、河南、湖北和四川等地，除华南地区外，其他各地均有栽培，日本也有栽培(裴红宾等，2006；中国科学院《中国植物志》编辑委员会，1992)。连翘不仅是重要的经济树种，也是传统的中药材，其果实具有清热解毒，散结消肿，利尿排石等功效(朱小强等，2005)。连翘自然结实率低，果实品质差，已不能满足药用的需求。目前，国内外对连翘的研究主要以化学成分和药理学作用为主(国家药典委员会，2005；李发荣等，2004；邱娟等，2007；王娅丽等，2006；张玲等，1999；赵咏梅等，2005)，在生殖生物学方面，除李进宇等(2006)对连翘花的结构、陈旭辉等(2006)对连翘的花芽分化及发育进行了观察研究外，迄今对于连翘的授粉受精过程的研究尚未见报道。本研究以长花柱和短花柱2种类型的连翘为试材，对自花授粉和杂交授粉条件下的授粉受精过程及各阶段持续的时间进行了观察，旨在找出连翘结实率低的一些原因，为连翘栽培和育种工作提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为长花柱类型和短花柱类型的连翘，均取自河北省井陉县苍岩山镇洞阳坡连翘种植基地。

1.2 方法

2008年3月中旬—4月下旬选取生长健壮、发育良好的连翘树, 在开花前2天，选取大小一致的花蕾，人工去雄，套袋隔离。于开花当天，取新鲜花粉分别进行自花授粉(长花柱植株自交，短花柱植株自交)和杂交授粉(长花柱类型×短花柱类型、短花柱类型×长花柱类型)，授粉后立即套袋，并挂牌标记。

授粉后1~12 h，每2 h取样1次；授粉后24~168 h，每24 h取样1次；授粉后8~15天，每天取样1次；授粉后16~30天，每3天取样1次。取样后立即放入FAA(甲醛:冰醋酸:70%乙醇=5:6:89)固定液中固定。

授粉后168 h以前的材料用8 mol·L^-1 NaOH软化6 h，蒸馏水冲洗干净，放入苯胺蓝溶液(0.1%苯胺蓝+0.01%磷酸二氢钾)染色2 h，整体压片。在Axioskop 40型荧光显微镜下观察花粉粒萌发和花粉管伸长情况，采用自动影像采集系统照相。

授粉后48 h~30 d的材料用酒精系列脱水、二甲苯透明、常规石蜡切片法切片，切片厚度8~10 μm，铁钒-苏木精染色，固绿对染，在Axioskop 40型显微镜下观察花粉管进入胚囊及受精过程，记录从授粉到受精所需时间。

2 结果与分析 2.1 自交和杂交花粉萌发及花粉管生长的比较

荧光显微镜观察表明，以长花柱连翘为母本的授粉组合(长♀×短♂)，授粉后4 h，花粉在柱头上开始吸水膨胀，有少量花粉萌发(图 1-1)，花粉管从其中1个萌发孔中伸出；授粉后6 h，萌发的花粉数明显增多(图 1-2)，花粉管经乳突细胞开始进入柱头；授粉后48 h，花粉管已穿过柱头开始进入花柱，此时在花粉管中可见环状的胼胝质塞(图 1-3)；授粉后72 h，花柱内已有大量花粉管，有的已达花柱的中部(图 1-4)；授粉后96 h，少数花粉管已达花柱基部，开始进入子房(图 1-5)，进入子房腔内的花粉管沿中轴胎座表面向胚珠的珠孔方向生长(图 1-6)；授粉后168 h，花粉管开始进入胚珠(图 1-7，8)。

与长花柱型连翘为母本的授粉组合(长♀×短♂)相比，短花柱型连翘为母本的授粉组合(短♀×长♂)，花粉萌发较早，授粉后2 h花粉即开始萌发，48 h花粉管已到达花柱中部，72 h开始进入子房，96 h到达子房底部，120 h即开始进入胚珠。

连翘自花授粉(长♀×长♂和短♀×短♂)，花粉萌发、生长都缓慢，长花柱连翘自花授粉后12 h才有少量花粉开始萌发(图 1-9)，授粉后48 h，柱头上产生大量胼胝质，花粉管开始停止生长(图 1-10)。短花柱连翘自花授粉后10 h少量花粉开始萌发，授粉后96 h，极少数花粉管萌发伸长至花柱(图 1-11)，120 h开始进入子房(图 1-12)，授粉后144 h极个别胚珠有花粉管进入。

2.2 连翘雌配子体的发育类型

石蜡切片观察表明，连翘的雌配子体发育类型为蓼型，授粉后96 h胚珠内的雌配子体已经发育为成熟胚囊。胚囊珠孔端为卵器，2个助细胞位于同一平面，染色较深(图 2-1)，卵细胞核呈球形，核中染色质分布均匀，有一明显核仁，卵细胞与助细胞呈三角形排列；中央细胞体积较大，2个极核或横向排列或纵向排列，受精前2个极核有的已融合成1个次生核(图 2-2)，其内有一大核仁，有的则仍保持2极核状态(图 2-3)。中央细胞的细胞质沿胚囊壁分布，联系卵器与次生核。成熟胚囊时期3个反足细胞已经退化，只留下一些残留物(图 2-4)。

2.3 连翘杂交授粉的受精过程

石蜡切片观察表明，长花柱连翘为母本(长♀×短♂)或短花柱连翘为母本(短♀×长♂)的受精过程基本一致。授粉后18天，花粉管进入胚囊，释放内容物质和2个精细胞(图 2-5)。精子呈椭球形，染色较深，其中1个精细胞向卵细胞移动，贴合于卵细胞的一侧(图 2-6)，另1个精子向极核移动(图 2-7, 8, 9)，贴合于中央细胞的一侧(图 2-10)；随后精核进入卵细胞，卵核较浅，精核较深，接着精核和卵核融合形成合子(图 2-11)，合子经过休眠期后开始纵向伸长成为细长的指状(图 2-12); 同时另1个精子与中央细胞融合形成胚乳细胞(图 2-13, 14)，胚乳细胞经有丝分裂形成次生胚乳核(图 2-15, 16)。

2.4 连翘自花授粉的受精过程

石蜡切片观察表明，自花授粉后18天，长花柱连翘未见有花粉管进入的胚囊，与荧光显微镜观察的结果一致；授粉后21天，胚囊内的卵细胞、中央细胞及助细胞已经退化消失(图 2-17)；授粉后24天，胚珠萎缩，胚囊已成为空腔(图 2-18)，胚囊壁细胞也开始变褐，死亡(图 3-1)。短花柱连翘授粉后27天，子房内可见有极少数受精膨大的胚珠(图 3-2，3)，表明短花柱连翘的自交不亲和程度较长花柱的弱。

3 讨论与结论

被子植物双受精的识别是多位点的, 可分为花粉与柱头、花粉管与花柱及雌雄配子之间3个层次, 任何一个部位不能识别都会导致生殖障碍(王文和等，2007)。本研究表明，长花柱连翘自花授粉后，少量花粉管能够进入花柱内, 但生长速度缓慢, 最后在花柱中停止生长；短花柱连翘自花授粉，花粉萌发后花粉管虽然生长缓慢，但最终有极少数胚珠受精。由此可以推测，连翘无论是长花柱类型还是短花柱类型均是自交不亲和的，但短花柱连翘的不亲和程度较长花柱类型弱，这可能与短花柱连翘的花柱较短花粉管更容易穿过花柱进入子房有关。连翘的这种自交不亲和性可能是造成连翘自然结实率低的一个重要原因。

在2种花柱类型连翘相互授粉的情况下，授粉后168 h花粉管开始进入珠孔，但进入胚囊释放精细胞和内容物的时间却是在授粉后18天。分析其原因，可能是其珠心组织较厚所致。据研究，珠心组织的厚度在不同植物类型间存在着很大差异，珠心组织较薄的胚珠，花粉管可以很快进入胚囊，但珠心较厚的胚珠，花粉管通过厚实的珠心组织常常需要较长的时间(陆时万等，1991)。另外，花粉管进入胚囊、完成受精作用所需的时间与基因型有关，如苹果(Malus pumila)由传粉到受精的时间为5天，栎属(Quercus)植物则需长达1年或1年多，而棉花(Gossypium)仅需15~32 h，水稻(Oryza sativa)1.5 h，小麦(Triticum aestivum) 1 h。此外，温度、花粉生活力的高低、花粉数量的多少等也都是影响花粉管生长速度的因素(曹慧娟，1992)。

长花柱连翘或短花柱连翘自花授粉结实率极低，若单独栽植长花柱或短花柱连翘，几乎只开花不结果(党建昌等，2003；朱小强等，2004)。所以，在连翘种植过程中必须将2种植株混栽, 以提高结实率。