雷公藤(Tripterygium wilfordii)系卫矛科(Celastraceae)雷公藤属植物，不仅是一种重要的药用植物，又是著名的杀虫植物。现已从中分离出70多种化学成分，其中雷公藤内酯醇又称雷公藤甲素，是中药雷公藤的主要有效成分之一，作为免疫抑制药物，可应用于许多自身免疫性疾病的治疗(Chen，2001)。雷公藤生物碱具有明显的体液和细胞免疫抑制作用，也是治疗类风湿性关节炎的有效成分(Luck et al., 2000a; 2000b；Duan et al., 2001)，同时还发现有抗肿瘤、抗雄性生育作用(Qian et al., 1995)。在农业害虫防治中，雷公藤内酯醇有较好的触杀活性(罗都强等，2001)，雷公藤总生物碱有较好的胃毒毒杀活性和拒食活性(李琰等，2008；周琳等，2006；Gonzalez et al., 1997)。通常使用的雷公藤有效成分都是从雷公藤根中提取的，其原料来源和产量都受到限制。加上这些有效成分人工合成困难，价格昂贵，市场需求量大，而且资源日益遭到破坏，因此，通过细胞培养技术生产雷公藤有用次生代谢物质，具有特殊的理论和现实意义(于树宏等，1998)。

前人研究发现，植物组织培养中细胞常常生长在异养条件下，碳源作为细胞的主要能量来源，是组培中不可缺少的组分。不同的培养细胞适合生长和次生代谢产物积累的碳源种类不同(Smith et al., 1997)。由于植物组织或细胞在离体培养条件下往往缺乏合成生长素与细胞分裂素的能力，外源激素就成了培养基中不可缺少的关键物质，其中以生长素和细胞分裂素最为常用，其用量极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导、生长以及次生代谢产物的含量起着重要作用(陈正华，1986)。因此，碳源和植物生长调节剂是影响愈伤组织培养的重要因素，为此本文进行了碳源和植物生长调节剂对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响试验，旨在筛选雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量较高的碳源以及植物生长调节剂组合，为进一步进行组织培养生产雷公藤内酯醇和雷公藤总生物碱奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用雷公藤采自福建省泰宁地区，取其1年生枝条，扦插于苗床上，1个月后长出的新根作为外植体进行愈伤组织诱导。形成愈伤组织在6，7-V+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.5 mg·L^-1 KT培养基上连续培养5代以上，形成的愈伤组织为供试材料。

1.2 仪器与药剂

日本岛津LC-6ATVP高效液相色谱仪，紫外检测器。UV120-02型紫外/可见分光光度计(日本岛津)。雷公藤内酯醇标准品(批号1566-200201，纯度95%)由中国药品生物制品鉴定所提供。雷公藤总生物碱，由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供，为本课题组从雷公藤根皮中提取得到，经光谱鉴定结构HPLC面积归一法测定纯度大于95%。甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，水为超纯水，1-萘乙酸(NAA)(上海化学试剂公司，化学纯)，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)(上海试剂四厂，化学纯)，6-糠胺基嘌呤(KT)，6-苄胺嘌呤(6-BA)(In Vitro Diagnosticum Sanland International Inc.，化学纯)；蔗糖(广东西陇化学试剂有限公司，分析纯)，葡萄糖(天津博迪化工有限公司，分析纯)，麦芽糖(上海试一化学试剂有限公司，分析纯)，乳糖(北京奥博生物技术责任有限公司，分析纯)，果糖(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，可溶性淀粉(天津登丰化学试剂有限公司，分析纯)，乙酸乙酯(西安化学试剂厂，分析纯)，其他试剂均为分析纯。

1.3 碳源及植物生长调节剂筛选

碳源筛选采用NT培养基，添加1.0 mg·L^-12，4-D和0.5 mg·L^-1 KT；以NT为基本培养基添加不同浓度2，4-D，NAA及与6-BA，KT组合，用于研究不同植物生长调节剂及其组合对雷公藤愈伤组织生长和雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱含量的影响。

以上培养基，加入碳源及蔗糖和麦芽糖组合试验所用碳源总量均为30 g·L^-1，用琼脂6 g·L^-1固化，pH用PHS-2C型酸度计高压灭菌前调至5.8。试验每个处理接种30瓶，每瓶接种大小基本相近的愈伤组织3块，总鲜质量控制在0.3~0.4 g。培养室温度(25±1)℃，采用自然光照。培养50天后收获，冷冻干燥至恒质量，粉碎过60目筛并计算愈伤组织增长量(愈伤组织增长量=收获量/瓶-接种量/瓶)。

1.4 次生代谢产物含量的测定 1.4.1 样品的制备

精密称取雷公藤愈伤组织样品1 g，置磨口三角瓶中，加入乙酸乙酯20 mL浸泡过夜，超声提取40 min，过中性氧化铝柱(含3 g中性氧化铝，玻璃柱d=1.0 cm)，然后用20 mL乙酸乙酯冲洗柱子，合并洗脱液，减压回收乙酸乙酯至干，用流动相溶解并定容至5 mL容量瓶中。

1.4.2 雷公藤内酯醇的测定

内酯醇的测定采用高效液相色谱(HPLC)法(李琰等，2009)。色谱柱C₁₈，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：甲醇:水体积比为45:55；流速：1 mL·min^-1；检测波长：218 nm；以内酯醇为标准品，其回归方程A=46 866C-10 771，R²=0.999 9。

1.4.3 雷公藤总生物碱的测定

紫外分光光度法测定总生物碱的含量，将提取液用45%甲醇稀释10~30倍，用紫外/可见分光光度计在268 nm波长下进行比色测定吸光度(李琰等，2009)；以总生物碱为标准品，其回归方程为A=0.008 7C-0.008 1，R²=0.999 8。

2 结果与分析 2.1 碳源对雷公藤愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响

培养基中糖不仅起到碳源的作用，而且还有调节渗透压的作用，因而对愈伤组织生长和次生代谢产物的含量有明显影响。试验结果表明，对雷公藤愈伤组织的增长量以蔗糖最高，可溶性淀粉最低，增长量仅为蔗糖的59%(表 1)。雷公藤内酯醇含量和产量以麦芽糖作为碳源时最高，其中雷公藤内酯醇含量为蔗糖的1.7倍。总生物碱含量和产量以葡萄糖最高，为蔗糖的1.3倍，但单纯使用葡萄糖时愈伤组织增长量为蔗糖的78%，雷公藤内酯醇产量仅为蔗糖的64%。

2.2 蔗糖和麦芽糖组合对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响

培养基中加入适当麦芽糖不仅可以促进雷公藤愈伤组织的生长，对雷公藤内酯醇的合成也起促进作用(表 2)。当20 g·L^-1蔗糖和10 g·L^-1麦芽糖组合时愈伤组织增长量最高，为单独使用蔗糖的1.1倍。随着麦芽糖质量浓度的增加，雷公藤内酯醇含量和产量逐渐升高。而总生物碱的含量在加入5 g·L^-1麦芽糖时最高，然后随着麦芽糖质量浓度的增加而下降。

2.3 生长素类对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响 2.3.1 2，4-D对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响

不同质量浓度2，4-D对雷公藤愈伤组织生长、雷公藤内酯醇及总生物碱含量的影响差异较大(表 3)。愈伤组织增长量随着2，4-D质量浓度的升高而变化，当2，4-D质量浓度为1.0 mg·L^-1时，达到最大值，此时愈伤组织生长最旺盛，呈颗粒状，结构疏松、富有光泽。然而随着2，4-D的质量浓度继续升高，其愈伤组织的生长量反而下降。而愈伤组织中雷公藤内酯醇的含量随着2，4-D质量浓度的升高而降低，但雷公藤内酯醇的产量是在2，4-D质量浓度为1.0 mg·L^-1时达到最大值。总生物碱的含量在2，4-D质量浓度为4.0 mg·L^-1时达到最大值，此时产量也最高。可见雷公藤愈伤组织生长、愈伤组织中雷公藤内酯醇及总生物碱的积累所需的2，4-D质量浓度各不相同，有关机制有待于进一步研究。

2.3.2 不同浓度NAA对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响

从表 4可以看出，随着NAA质量浓度的增加愈伤组织的增长量有所增加，NAA质量浓度为4.0 mg·L^-1时达到最大值。雷公藤内酯醇的含量随着NAA质量浓度的增加而降低，但雷公藤内酯醇的产量、总生物碱的含量及产量是在NAA质量浓度为4.0 mg·L^-1时达到最大值。2，4-D和NAA在最佳浓度时，雷公藤愈伤组织增长量相当，但加入NAA的培养基生长的愈伤组织致密、呈块状，愈伤组织褐化程度明显高于加入2，4-D的培养基，并且继代后生长迟缓并逐渐干枯，不适合进一步继代培养。

2.4 生长素与细胞分裂素相互作用对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响 2.4.1 2，4-D与6-BA，KT相互作用对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响

用1.0 mg·L^-1 2，4-D和细胞分裂素KT配合使用，当KT质量浓度为0.5 mg·L^-1时(表 5)，愈伤组织增加量达到最大，愈伤组织增加量随着KT质量浓度的增加而下降，但均比单独使用2，4-D时高。雷公藤内酯醇含量随着KT质量浓度的增加而下降，雷公藤内酯醇产量在KT为0.5 mg·L^-1时达到最大值。而总生物碱含量则随着KT质量浓度的增加而上升。总生物碱产量是在KT为2.0 mg·L^-1时达到最大值。

含1.0 mg·L^-1 2，4-D的培养基中加入6-BA后，对愈伤组织生长起抑制作用，并且随着6-BA质量浓度的增大愈伤组织增长量逐渐下降，均低于单独使用2，4-D。雷公藤内酯醇含量随6-BA质量浓度的增加而上升，均较单独使用2，4-D高。雷公藤内酯醇产量也在加入1.0 mg·L^-1 6-BA时为最高。总生物碱含量随着6-BA质量浓度的增加而下降，但均高于单独使用2，4-D。6-BA的加入培养基褐化程度明显高于KT的加入，并且随着6-BA、KT质量浓度的增加，褐化程度有加深的趋势。

2.4.2 NAA与6-BA，KT相互作用对愈伤组织生长及雷公藤内酯醇和总生物碱含量的影响

用4.0 mg·L^-1 NAA和细胞分裂素KT配合使用时，当KT质量浓度为0.5 mg·L^-1时(表 6)，愈伤组织增长量达到最大，愈伤组织增长量和雷公藤内酯醇含量随着KT质量浓度的增加而下降。均低于单独使用NAA，雷公藤内酯醇产量也在单独使用NAA时最高。总生物碱含量均高于单独使用NAA，但随着KT质量浓度的增加总生物碱含量也趋于下降。总生物碱产量是在KT为0.5 mg·L^-1时达到最大值。

含4.0 mg·L^-1 NAA的培养基中加入6-BA后，对愈伤组织生长起抑制作用，并且随着6-BA质量浓度的增大愈伤组织增长量逐渐下降，均低于单独使用NAA。雷公藤内酯醇含量也随6-BA质量浓度的增加而下降，但均较单独使用NAA高，雷公藤内酯醇产量是在加入0.5 mg·L^-1 6-BA时为最高。总生物碱含量随着6-BA质量浓度的增加而下降，也均高于单独使用NAA。

3 结论与讨论

本试验研究结果表明，对雷公藤愈伤组织的增长量以2%蔗糖和1%麦芽糖组合时最高，雷公藤内酯醇含量以麦芽糖最高，总生物碱含量以葡萄糖最高。范美华等(2004)在研究半夏(Pinellia ternata)悬浮培养细胞生长及总生物碱形成时发现，葡萄糖比蔗糖利于细胞的生长和总生物碱的合成。杨世海等(2006)研究发现，甘草(Glycyrrhiza uralensis)愈伤组织培养中果糖是适宜碳源，其中2%果糖最有利于愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物的生物合成；Kim等(1995)研究也表明，紫杉醇合成的最佳碳源是果糖；赵德修等(1998)在研究水母雪莲(Saussurea medusa)培养细胞中黄酮类形成时发现，5%蔗糖+1%葡萄糖的组合对雪莲愈伤组织生长不仅有利，而且干细胞中总黄酮的含量也为最高。可见，不同的培养细胞适合生长和次生代谢产物积累的碳源种类差异较大。但在较大规模生产中，由于蔗糖来源容易、价格较低，所以在植物细胞培养中通常以蔗糖作为主要碳源使用。

试验发现，植物生长调节物质对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢物质生产的影响较大。不加激素的培养基上，愈伤组织接种后几乎没有生长，逐渐褐变、枯死。2，4-D的加入有利于雷公藤愈伤组织的生长和总生物碱的积累，而对雷公藤内酯醇的积累起抑制作用。NAA的加入虽然对愈伤组织的生长起促进作用，但形成的愈伤组织致密，褐化程度明显高于加入2，4-D的培养基，NAA的加入有利于雷公藤内酯醇的积累，而对总生物碱的积累起抑制作用。6-BA对愈伤组织的生长起抑制作用，但明显促进愈伤组织中雷公藤内酯醇的形成；KT虽然对愈伤组织的生长起促进作用，但明显抑制愈伤组织中雷公藤内酯醇的形成；6-BA和KT的加入均不同程度地促进总生物碱的积累。而在雷公藤愈伤组织诱导中发现(李琰等，2008)，KT的效果明显优于6-BA。而在杜仲(Eucommia ulmoides)愈伤组织诱导中发现，KT对愈伤组织形成有明显的抑制作用(李琰等，2004；唐建军等，2002)，可见，植物生长调节剂对愈伤组织诱导、生长和次生代谢作用的复杂性。目前，各种激素相互作用的机制尚不明确，有待于做进一步的研究。培养基中外源激素的种类、浓度及组合对培养材料的褐变起着重要作用(王玲等，2004)，在细胞分裂素中，一般认为6-BA有刺激多酚氧化酶(PPO)活性提高、加重褐变的作用(李冬杰等，2005)。本研究发现培养基中添加NAA，6-BA明显促进雷公藤愈伤组织中雷公藤内酯醇的合成，但对总生物碱的合成起抑制作用，但培养基中添加NAA，6-BA后褐化程度明显加重。可见培养基成分、添加激素的种类和浓度、培养条件等作为外因，都会影响褐变的产生。