马尾松(Pinus massoniana)是我国特有的速生、丰产乡土树种，是南方主要的造林树种和工业原料树种，其木材和松脂是许多森林工业、林产工业和造纸工业的支柱，在林业生产中占有重要地位(莫江明等，2004；周政贤，2001)。马尾松在我国的分布区域广泛，遍及南方15个省(区)，纬向(N)纵越12°，经向(E)横跨20°。分布区内地理环境条件变化多端，由于长期自然选择和生殖隔离等原因，马尾松存在着极为丰富的遗传变异(周志春等，1997)，但有性世代易造成优良性状的分化，单纯实施有性繁殖，不利于有效开展林木遗传改良工作和优良性状的保持。多年来马尾松一直采用实生苗造林，导致很多地区的马尾松林木生长速度缓慢，多年难以郁闭成林，不能尽快发挥其生态和经济效益。为最大限度地提高林木改良过程中的遗传增益，避免优良基因型材料在扩繁中发生分化，林木无性繁殖已成为最适的技术手段。扦插繁殖作为无性繁殖中的一种简便、实用、经济的技术，更是林业工作者关注的焦点。20世纪90年代以来，林业科研人员对马尾松扦穗生根的环境因子(主要是光、水、温、气和基质)、促根防腐剂筛选使用及插穗制备等开展了研究，取得了一些研究成果(来端等, 2004；余能健等, 1992；季孔庶, 1998；张全仁等, 1993；秦国峰, 1994；陈宏胜, 2005)，但由于马尾松是难生根树种，扦插生根率很不稳定，有关马尾松扦插繁殖的技术成果很少应用于生产实践。为了能持续稳定地获得马尾松优良无性繁殖苗，本文将对与马尾松扦插生根相关的内源因素进行研究，分析马尾松插穗生根过程的生理生化指标的变化，探寻马尾松的生根机制，为确定正确的马尾松扦插繁殖技术提供科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料来源

试验用插穗来源于重庆亚克林业有限公司马尾松采穗圃，采穗圃中的马尾松母株为3年生容器苗。扦插试验于2007年3月在西南大学温室大棚内进行。

1.2 扦插试验设计

扦插试验采用完全随机区组设计，3次重复，每个区组将对照和用GGR6浸蘸的插穗各插450条，3个区组总计扦插2 700条。

1.3 扦插条件

扦插的前一天在采穗圃内选择生长健壮、整齐一致、无病虫害的马尾松母株剪取半木质化枝条带回试验地，当天晚上用流水将剪取的枝条浸泡，扦插前截取半木质化枝条的上部作为插穗，截取长度为8~10 cm，粗度为0.5 cm，顶部带顶芽，下切口平剪，去除插穗基部针叶，然后将剪好的插穗先用35 ℃温水浸泡0.5 h，再用0.2%多菌灵溶液消毒，再用0.2 mg·kg^-1的GGR6浸蘸0.5 h，以清水处理作对照(CK)。扦插基质为珍珠岩、林下黄土、针叶腐殖土的混合基质(体积比为4:3:3)。

1.4 插后管理

扦插后遮光率一直控制在70%左右(用遮荫网控制)，温度控制在20~30 ℃，相对湿度控制在80%~90%，按照需要进行喷雾处理，各区组条件相同，并进行常规管理。

1.5 取样及样品处理

扦插后每隔10天采样1次，每个测定指标均在3个区组各随机取5株，进行3次重复测定。采样后洗净吸干，先观察其生根情况，然后取插穗基部3 cm的皮层分别测定其多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性、黄酮类物质含量等。营养物质的测定是将随机取出的插穗在110 ℃烘箱中迅速杀青，再于70 ℃下烘至恒量，经粉碎过筛后，测定可溶性糖含量和总氮含量。

1.5 测定方法

多酚氧化酶(PPO)活性采用李忠光等(2005)改进的方法测定；过氧化物酶(POD)活性、可溶性糖含量、总氮含量采用萧浪涛等(2005)的方法测定；吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性用比色方法测定(张志良等，2004)；黄酮含量采用国家药典委员会(2005)黄酮测定方法。PPO活性以每克鲜品每分钟A₄₁₀光密度变化0.01个单位所需要的酶液量作为1个活力单位(U)；POD以每分钟内A₄₇₀变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)；IAAO以每克鲜品在1 h内分解破坏IAA的毫克数表示1个酶活性单位(U)。

2 结果与分析 2.1 马尾松扦插苗生根特性

研究发现(表 1)，马尾松半木质化插穗经生根剂GGR6处理后扦插，39天后开始形成愈伤组织，55天后开始形成不定根，110天时生根调查显示生根率为79%；不定根条数范围为1~10条，平均不定根条数为4条；生根植株最大根长为5.83 cm，平均根长为3.53 cm，幼苗根系总长度平均为15.18 cm；最大根粗为1.58 mm，平均根粗为1.15 mm。对照插穗扦插后，45天后才开始形成愈伤组织，71天后才开始形成不定根，110天时生根调查显示生根率为15%；不定根条数范围为1~7条，平均不定根条数为2条；生根植株最大根长为3.02 cm，平均根长为2.38 cm，每个幼苗根系总长度平均为5.68 cm；最大根粗为1.08 mm，平均根粗为0.73 mm。所有指标均比用生根剂GGR6处理的差。经观察所有扦插苗都是从愈伤部位生出的不定根，未发现有皮部生根现象，因此马尾松半木质化枝条扦插生根应为愈伤组织生根类型。

2.2 马尾松扦插生根过程相关酶活性变化 2.2.1 PPO活性变化

酚类物质对不定根的发生和发育起着极其重要的作用(Balakrishnamurthy et al., 1988)，马尾松扦插苗中含有大量的酚类化合物，是抑制马尾松扦插生根的主要內源物质之一(季孔庶等，1997)，而PPO的一个重要生理功能就是催化酚类物质和IAA形成一种“IAA-酚酸复合物”(Haissig, 1974)，这种复合物是一种生根的辅助因子，能够促进不定根形成的活性(Bassuk et al., 1981)，PPO还能催化生长素的代谢，促进不定根的发生与发育(Bhattacharya, 1989)。因此PPO活性的大小与根的发生有重要关系。用GGR6处理的马尾松插穗在前40天PPO活性持续上升，40天达到最大，此后PPO活性逐渐下降。对照马尾松插穗中PPO的活性与用GGR6处理的变化趋势类似，但峰值的出现比用GGR6处理的晚，用GGR6处理插穗PPO活性比对照高(图 1)。GGR6处理和对照之间PPO活性的差异达到显著水平(F=7.77，P=0.010 7＜0.05)。扦插初期PPO活性较低，催化生成的“IAA-酚酸复合物”较少，随扦插时间的延长，PPO活性升高，可能导致生成的“IAA-酚酸复合物”也相应增多，促进了根的形成。GGR6处理使插穗中PPO活性较对照高，生根效果也较对照好，这一结果与扈红军等(2008)对榛子(Corylus heterophylla)嫩枝扦插所得的结论基本一致。

2.2.2 POD活性变化

POD的活性与离体植物生根有密切关系，POD是植物生根标志性物质之一(Gaspar et al., 1992)。POD作用的某些产物可能是不定根发生和发展所必须的辅助因子，能促进不定根的形成(宋丽红等，2005)。在有酚类物质存在的条件下，POD还参与生长素的代谢和细胞壁的木质化(Gyana, 2006)。用GGR6处理的马尾松插穗中POD活性在扦插0~40天逐渐上升，在40~50天下降，在50~80天上升；其中在第40天和第80天各有1个明显的高峰(图 2)。对照中POD活性与GGR6处理的变化趋势基本相同，但经GGR6处理的插穗中POD活性比对照的高，两者之间POD活性差异达到极显著(F=8.653，P=0.008 7 < 0.01)。

在马尾松扦插生根过程中，POD活性先迅速上升，之后迅速下降，然后再上升，整个生根过程POD活性有2个高峰出现，这与前人对其他植物的研究结果相符(Gebhardt, 1982；Pacheco et al., 1995；宋金耀等，2001；扈红军等，2007)。POD活性有2个高峰出现可能与POD分别参与根的诱导和表达有关(Calderon-Baltierra, 1994)，在不定根诱导期和表达期，POD活性升高是有生根能力的标志(Moncousin et al., 1983；Nordstrom et al., 1991)。POD能氧化IAA，消除体内过多的内源IAA，有利于根原基的诱导。表达期的POD活性下降，导致体内IAA含量上升，有利于根原基发育及不定根的形成(扈红军等，2007)。

2.2.3 IAAO活性变化

IAA是一种植物生长素，具有多种生理功能，其中之一是能促进不定根的发生与发育，而IAAO可以氧化IAA，因此IAAO活性的大小与根的发生有重要关系。在马尾松扦插生根过程中，插穗内IAAO活性随生根的不同阶段而发生规律性变化，经GGR6处理的马尾松插穗内IAAO活性在扦插0~40天逐渐上升，之后大幅度下降，IAAO活性高峰出现在愈伤组织形成期。对照与经GGR6处理的插穗中IAAO活性变化趋势基本相同，但对照插穗中IAAO活性变化较小，高峰值不明显。有研究认为植株离体生根的诱导期，高活性的IAAO使内源IAA水平降低，低含量的IAA有利于生根；在表达期IAAO活性降低使得植株內源IAA含量升高，高含量的IAA能促进根的生长(Gaspar et al., 1992；Pacheco et al., 1995；Moncousin, 1986；宋金耀等，2001；扈红军等，2008；曹帮华等，2008)，本试验的结果也与此相一致。

2.3 马尾松扦插生根过程黄酮类物质变化

黄酮类物质是抑制马尾松扦插生根的主要內源物质之一，其含量变化直接影响马尾松扦插苗的生根率(季孔庶等，1997)。本试验结果显示(图 4)，马尾松插穗在扦插生根过程中內源黄酮类物质含量发生规律性变化，经GGR6处理的马尾松插穗内黄酮类物质含量在扦插0~30天逐渐下降，30~50天大幅度上升，50天以后又逐渐下降，其高峰出现在插穗愈伤组织大量形成期。对照插穗中黄酮类物质含量与经GGR6处理的插穗变化趋势基本相同，但对照插穗中黄酮类物质变化时间有所滞后，变化幅度较小。有研究表明植物离体生根与其组织中的黄酮类物质含量有关(Curir，1992；Berthon et al., 1993；Pacheco et al., 1995；宋金耀等，2001)。黄酮类物质对植物不定根的诱导和表达的作用不同，Berthon等(1993)在松树离体组织培养中发现，在诱导期黄酮类物质对生根有抑制作用，在表达期黄酮类物质则对生根有促进作用。本研究发现经GGR6处理的马尾松插穗在生根诱导期内源黄酮类物质含量逐渐减少，在生根表达期内源黄酮类物质含量大幅度上升，这有利于马尾松插穗的生根。黄酮含量的变化与过氧化物酶活性变化有关，过氧化物酶活性的高峰值总是对应着黄酮含量的最低值(Pacheco et al., 1995；宋金耀等，2001)，本试验也得到相同的结果。

2.4 马尾松扦插生根过程营养物质变化

营养物质是插穗生根的基本条件之一。马尾松在整个扦插过程中可溶性糖含量发生规律性变化，用GGR6处理的马尾松插穗内可溶性糖含量在扦插初期变化较小，扦插后20~70天可溶性糖含量急剧增加，由35.2 mg·g^-1增加到59.5 mg·g^-1，第70天达到高峰，之后可溶性糖含量又逐渐减少(图 5)。对照插穗中可溶性糖含量与经GGR6处理的插穗变化趋势基本相同，但对照插穗中可溶性糖含量变化比用GGR6处理的时间滞后，变化幅度较小，詹亚光等(2001)对白桦(Betula platyphylla)扦插研究中也有相同的结果，说明外源生根促进剂能明显加快插条基部糖的积累，促进不定根的形成。

马尾松扦插过程中总氮含量变化规律不明显，不论是用生根剂GGR6处理还是对照的插穗，其总氮含量在马尾松插穗生根过程中变化幅度均很小，用GGR6处理的插穗中总氮含量变幅仅为0.41%，对照插穗中总氮含量变幅仅为0.36%，用GGR 6处理对马尾松扦插过程中总氮含量的影响很小，这与詹亚光等(2001)对白桦扦插所得的结论相一致，但郭素娟等(2004)研究认为总氮含量与白皮松(Pinus bungeana)的扦插生根有一定的正相关关系，说明总氮对于插穗生根影响较为复杂。关于总氮与生根的关系有待进一步研究。

3 结论

马尾松为难生根树种，常规扦插生根率极低，用生根促进剂GGR6处理能显著提高其生根率和生根质量；马尾松属于愈伤组织生根类型。

马尾松嫩枝扦插生根过程中，PPO，POD和IAAO等3种氧化酶活性均呈规律性的变化，与不定根形成均有密切关系；愈伤组织诱导与形成期，3种酶活性均大幅度上升；整个生根过程中PPO活性有2个高峰出现，而POD和IAAO 2种酶只有1个峰值，3种氧化酶对生根的影响机制是不同的。

马尾松插穗在扦插生根过程中內源黄酮类物质含量发生规律性变化，其高峰出现在插穗愈伤组织大量形成期。对照插穗与经GGR6处理的插穗中黄酮类物质含量变化趋势基本相同，但对照插穗中黄酮类物质变化时间有所滞后，变化幅度较小。

马尾松在整个扦插过程中可溶性糖含量发生规律性变化，可溶性糖含量峰值出现在生根高峰期；生根剂GGR6能使可溶性糖的峰值提前，且能明显提高插穗基部可溶性糖的积累，促进不定根的形成。总氮含量变化规律不明显，不论是用生根剂GGR6处理还是对照的插穗，其总氮含量在马尾松插穗生根过程中变化幅度均很小。