月季(Rosa hybrida)切花在全球花卉贸易中销售量和销售额均居切花之首，而其对失水胁迫十分敏感，往往因失水而导致僵蕾、萎蔫、弯颈等，使得花朵不能正常开放，进而缩短瓶插寿命，影响切花品质(高俊平等，1994；1996)。探明月季切花失水胁迫耐性机理，在实践中提高月季切花失水胁迫耐性，对研究切花采后保鲜技术具有理论和实践意义。

植物遭受失水胁迫会加速植物衰老、死亡(De et al., 1987)，一方面由于失水胁迫会打破活性氧原有的代谢平衡，诱发氧化胁迫，致使细胞生理代谢紊乱，破坏膜结构(McCord et al., 1969)；另一方面由于内肽酶水解蛋白造成蛋白水解活性的上升和总蛋白含量的下降(丛日晨等，2003a；2003b; 赵喜亭等，2005；曹慧等，2004)，有关这2方面的有关研究主要集中在小麦(Triticum aestivum)(吴小平等，1994；Srivalli et al., 1998)、蚕豆(Vicia faba)(Jones et al., 1995)、豇豆(Vigna unguiculata)(Khanna et al., 1999)等大田作物和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Koizumi et al., 1993)上。目前，根据月季切花失水胁迫后瓶插寿命缩短百分比将月季切花分为耐失水胁迫品种、中度耐失水胁迫品种和不耐失水胁迫品种(唐雪梅等，1999)，并且认为造成这种失水耐性的差异与花瓣中SOD(薛秋华等，1999；Ye et al., 1996)或内肽酶(丛日晨等，2003a; 2003b；赵喜亭等，2005；曹慧等，2004)的活性和种类存在较大的相关性。但对月季切花品种间花瓣和叶片失水耐性差异与抗氧化酶和内肽酶的系统研究未见报道。本试验选用‘Sunny leonidas’和‘Sun stone’2个切花月季品种，研究失水胁迫后不同品种间CAT，POD，SOD，MDA含量和内肽酶活性变化的差异，探讨品种间失水胁迫耐性差异与抗氧化相关酶活性与内肽酶活性之间可能的关联。

1 材料与方法 1.1 供试花材与失水胁迫处理

供试切花月季‘阳光雄师’(‘Sunny leonidas’)和‘日光石’(‘Sun stone’)，均购自昆明杨月季公司，采收标准为开花级数2级(唐雪梅等，1999)。

将花材在水中统一剪切，长度为25 cm，保留复叶3片。将花材置于温度20 ℃、相对湿度30%的环境中失水胁迫处理24 h，每个处理用10枝花材，重复3次，以一直插在蒸馏水中为对照。

在室温22~25 ℃、相对湿度60%、散射光下于蒸馏水中瓶插。瓶插期间定期进行形态学观察和有关生理指标测定。

1.2 切花水分状况测量

水分状况用鲜质量损失率和鲜质量变化率加以衡量，以胁迫处理前的鲜质量基准计算，用电子天平称量鲜质量的变化，瓶插期间逐日测定。

鲜质量损失率=(胁迫处理前鲜质量-胁迫处理后鲜质量)/胁迫处理前的鲜质量×100%；

鲜质量变化率=(当天鲜质量-前1天鲜质量)/胁迫处理前的鲜质量×100%。

1.3 切花形态学观测

开花级数的判断：依据唐雪梅等(1999)进行确定。2级为绽蕾期:萼片下垂，外层花瓣开始松散；3级为初开期:初开，外层花瓣展开；4级为盛开期:盛开，多层花瓣展开；5级为盛末期:盛末，花朵露心；6级为萎蔫期:花瓣翻转或开始萎蔫、蓝变、焦边。

花径增大率：依据蔡蕾等(2002)的方法测定。以处理前的花朵为基准计算，用游标卡尺量取花朵最大直径，瓶插期间逐日测定。

瓶插寿命：依据唐雪梅等(1999)的方法, 从瓶插之日起到花朵出现萎蔫、弯颈或蓝变等失去观赏价值现象的前1天的瓶插天数。

1.4 切花生理指标测定

按照瓶插天数取样，取中层花瓣和叶片参照薛秋华等(1999)的方法提取粗酶液。

MDA含量：取上述酶液2 mL，加入10%三氯乙酸(含0.6%TBA)2 mL混匀，于沸水浴加热20 min，冰中迅速冷却，离心，取上清液分别于532，600和450 nm波长下测定吸光度(Koizumi et al., 1993)。

SOD活性：取上述酶液0.05 mL，加入1.5 mL磷酸缓冲液(0.05 mol·L^-1，pH7.8)、0.3 mL甲硫氨酸(130 mmol·L^-1)、0.3 mL的NBT(750 μmol·L^-1)、0.3 mL的EDTA(100 μmol·L^-1)、0.3 mL的核黄素(20 μmol·L^-1)，混匀后，在4 000 lx荧光下照光20 min，测定样品在560 nm处的吸光度。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活单位表示(Koizumi et al., 1993)。

POD活性：取上述酶液0.1 mL，加入1.5 mL磷酸缓冲液(0.05 mol·L^-1，pH7.8)、2%的过氧化氢1 mL、愈创木酚1 mL(0.05 mol·L^-1)，34 ℃温育5 min，迅速稀释1倍，波长470 nm下测定吸光度，每隔1 min测1次，共测5次(Koizumi et al., 1993)。

CAT活性：取上述酶液0.2 mL，加入1.5 mL磷酸缓冲液(0.05 mol·L^-1，pH7.8)、1 mL蒸馏水、0.3 mL过氧化氢(0.1 mol·L^-1)，波长240 nm下测定吸光度，每隔1 min测1次，共测5次(Koizumi et al., 1993)。

内肽酶活性和种类测定：按照瓶插天数取样，取中层花瓣和叶片参照Ye等(1996)的方法提取粗酶液。参照Barbara等(1976)的方法，以偶氮酪蛋白(azocasein)为底物，在pH6条件下测量内肽酶活性(丛日晨等，2003)。花瓣和叶片内肽酶种类的测定参照赵喜亭等(2008)的方法，采用加入单一抑制剂乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)检测金属蛋白酶、苯基磺酰氟化物(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)检测丝氨酸蛋白酶、碘乙酸(Iodoacetic acid，IA)检测巯基蛋白酶的方法，确定内肽酶的种类，浓度均为1.0 mmol·L^-1。

1.5 数据分析

每试验组设3个重复，所有数据均在Excel软件中进行分析和绘图，差异显著性采用Duncan氏新复极差法分析。

2 结果与分析 2.1 失水胁迫对不同切花月季品种花朵开花质量的影响 2.1.1 开花级数和花径增大率

失水胁迫处理后2品种的开花进程都快于对照(图 1A)，‘Sun stone’尤为明显。2品种失水处理均在瓶插第3天盛开(4级)，‘Sunny leonidas’在第7天萎蔫(6级)，‘Sun stone’在第6天萎蔫。‘Sunny leonidas’盛开持续时间为3天，‘Sun stone’盛开持续时间为2天。未失水的2者差异不大，都在瓶插第4天盛开(4级)，第7天萎蔫(6级)。

花径增大率用来衡量切花开放程度。‘Sunny leonidas’和‘Sun stone’花径增大率的变化趋势基本相同(图 1B)，在瓶插前14天, 花径增大率均显著大于瓶插的前一天, 都在盛末期(5级)达到最大，2者分别增加了116%和133%；失水处理均抑制花朵的开放程度，‘Sunny leonidas’和‘Sun stone’的花径增大率比CK减少10%。

2.1.2 鲜质量损失率和瓶插寿命

失水程度用鲜质量损失率来衡量，失水24 h后‘Sunny leonidas’的鲜质量损失率为23.6%，‘Sun stone’为16.2%。可见前者比后者在遭受水分胁迫时更易损失水分。24 h失水胁迫后，‘Sunny leonidas’的瓶插寿命为5.6天，‘Sun stone’的瓶插寿命为4.1天，而没有进行失水胁迫的瓶插寿命分别为6.7天和6.5天。‘Sunny leonidas’的瓶插寿命缩短百分比为16.4%，‘Sun stone’的瓶插寿命缩短百分比为36.9%，说明‘Sunny leonidas’对失水胁迫耐性显著强于‘Sun stone’(表 1)。

从失水胁迫后鲜质量损失率和瓶插寿命缩短百分比看‘Sunny leonidas’易失水，但失水胁迫耐性高于‘Sun stone’；从失水胁迫后开花级数和花径增大率看失水胁迫促进花朵开放进程，花朵开放程度受到抑制，2者表现一定的相关性，‘Sunny leonidas’在瓶插第3~5天开花级数为4~5，处于盛开期，花径不断增大，随后减小；而‘Sun stone’在瓶插第3~4天开花级数为4~5，处于盛开期，花径不断增大，随后减小。

2.2 失水胁迫对不同切花月季品种MDA含量和抗氧化相关酶活性的影响

MDA是膜脂过氧化产物，其含量的高低反映膜系统受伤害的程度。图 2可看出：失水胁迫处理增加了2品种花瓣和叶片中的MDA含量，且花瓣和叶片表现相似的趋势，在整个瓶插期间均高于对照(P＜0.05)，尤其在失水胁迫24 h后，2者的MDA含量显著高于对照，失水胁迫耐性较强的品种‘Sunny leonidas’在失水处理后的瓶插期间花朵和叶片中MDA含量低于失水胁迫耐性较弱的‘Sun stone’，在瓶插前5天‘Sunny leonidas’的花朵和叶片中MDA增加较为平缓，而‘Sun stone’在瓶插第5天MDA含量显著增加，这与2品种失水胁迫后的开花指数和瓶插寿命结果相一致。上述结果表明：失水胁迫引起花朵和叶片的膜脂过氧化，且花瓣和叶片表现相似的趋势，失水胁迫耐性较强品种在失水24 h后MDA含量增加缓慢，有较长的瓶插寿命。

SOD是植物抵御活性氧伤害的重要酶类。图 3A和3B可知: 2品种花瓣中的SOD活性明显高于叶片，失水胁迫增加2品种叶片和花朵中SOD酶活性，在随后瓶插期间花瓣与叶片变化趋势不一致，花瓣中表现为降—升—降的趋势，失水胁迫耐性较强品种‘Sunny leonidas’的SOD峰值出现在瓶插第4天，而耐性较弱品种‘Sun stone’的SOD峰值出现在瓶插第3天；失水胁迫后叶片中SOD的变化趋势为持续升高。表明失水胁迫对花朵的影响大于叶片，花朵先于叶片衰老。

CAT是抗氧化的主要酶类，由图 3C和3D可知:经失水胁迫处理或CK的花朵和叶片在瓶插期间CAT活性均表现为先升后降的趋势；失水胁迫处理提高了花朵和叶片中CAT酶活性，但在瓶插期间花朵和叶片中CAT酶活性低于CK；从失水胁迫对2品种花朵和叶片的CAT活性差异看，CK的CAT活性的峰值出现在瓶插第5天，经失水胁迫的CAT活性的峰值出现在瓶插第4天，失水胁迫耐性较强品种‘Sunny leonidas’的花瓣和叶片中CAT活性高于‘Sun stone’品种。可见失水胁迫能引起花瓣和叶片CAT酶活性的增加，耐失水胁迫的品种在瓶插期间花瓣和叶片有相对较高的CAT活性。

POD是清除活性氧过氧化氢的主要酶类，失水胁迫显著增加2品种花朵中的POD酶活性，其中‘Sun stone’花瓣中POD活性增加45%，‘Sunny leonidas’花瓣POD活性增加223%。但失水处理对叶片POD酶活性的影响因品种不同有所差异，‘Sunny leonidas’叶片POD活性增加166%，而‘Sun stone’几乎没有增加, 表明失水胁迫对月季切花POD酶活性的影响不仅与品种有关，而且对同一品种、不同器官(花朵和叶片)中的POD酶活性影响也不同。复水后瓶插期间，‘Sunny leonidas’品种花瓣中POD酶活性表现为先显著降低后缓慢上升再上升的趋势，在瓶插第4天达到最高峰，叶片中POD酶活性一直是缓慢下降，在瓶插第6天甚至低于对照；‘Sun stone’品种花瓣POD活性则表现为先降低再快速上升再下降的趋势，在瓶插第3天达到高峰，叶片中POD在前期缓慢下降，到瓶插第5天开始上升，在瓶插第6天达到最大值。上述结果表明失水胁迫处理对‘Sunny leonidas’的影响大于‘Sun stone’，复水后前者有较强的恢复能力。

2.3 失水胁迫对不同切花月季品种内肽酶活性的影响

失水胁迫24 h后2品种花瓣和叶片的内肽酶活性均显著增加，在瓶插第1天即复水后又迅速降低，随后缓慢增加；‘Sunny leonidas’在瓶插第5天花瓣内肽酶活性迅速增加，‘Sun stone’则在瓶插第4天花瓣内肽酶活性迅速增加；而‘Sunny leonidas’和‘Sun stone’叶片中的内肽酶活性在复水后一直缓慢增加，与对照差异不明显。

2品种在瓶插期间花瓣和叶片的内肽酶活性持续上升，瓶插前5天花瓣表现为增加缓慢，在瓶插第6天内肽酶活性急剧升高，但叶片在整个瓶插期间一直缓慢增加，表明花瓣在瓶插第6天已进入衰老期，而叶片的衰老则相对滞后。从品种间内肽酶活性差异看，‘Sunny leonidas’的内肽酶活性一直高于‘Sun stone’。

上述结论说明:花瓣内肽酶活性的迅速增加与切花的衰老密切相关，‘Sunny leonidas’有较强的失水胁迫耐性与复水后内肽酶活性缓慢增加相关联，叶片比花朵有更强的失水胁迫耐性与花枝失水胁迫后复水内肽酶持续缓慢增加相关联。

2.4 失水胁迫对不同月季切花品种内肽酶种类的影响

失水24 h后瓶插期间，在pH6条件下采用蛋白酶专一性抑制剂对2品种的内肽酶种类进行测定。

2品种在失水胁迫及复水瓶插期间，花瓣中至少有金属蛋白酶、巯基蛋白酶和丝氨酸蛋白酶3种内肽酶存在(表 2)，其中金属蛋白酶和巯基蛋白酶的活性一直较低，而丝氨酸蛋白酶活性较高，在整个瓶插期间占主导地位。比较2品种失水胁迫及瓶插期间丝氨酸蛋白酶活性变化规律可看出: 2品种失水胁迫均提高丝氨酸蛋白酶的活性，‘Sunny leonidas’在瓶插前4天变化缓慢，且增加幅度较小，到第5天显著增加；而‘Sun stone’在前3天缓慢增加，增加幅度大于‘Sunny leonidas’，在第4天显著增加(P＜0.05)。2品种叶片的变化规律与花瓣类似，但变化幅度均小于花瓣。可见丝氨酸蛋白酶是影响切花衰老的主要酶类，推测2品种失水胁迫耐性之间的差异，与花瓣中丝氨酸蛋白酶活性诱导之间的差异有关。

3 讨论 3.1 月季切花品种间失水胁迫耐性与抗氧化酶之间的关系

失水胁迫引起生物膜受损伤的现象已被许多学者证实，但损伤机理尚不清楚。近年来，部分学者应用生物自由基伤害学说认为干旱增加植物体内的活性氧含量，促进膜脂过氧化作用或膜脂脱脂反应(McCord et al., 1969)，同时植物形成酶促和非酶促的抗氧化防御系统以保护细胞免受伤害，其中SOD, POD, CAT是清除活性氧过程中最重要的3种保护酶，SOD催化超氧自由基歧化反应生成O₂和H₂O₂，产生的H₂O₂再由POD和CAT除去(余叔文，1998)。

植物组织耐脱水能力与自身维持活性氧代谢平衡的能力有关，即与活性氧清除剂SOD，POD和CAT活性有关(单宁伟等，2005；李永红等，2003)。但同时研究月季切花品种间花瓣和叶片的失水胁迫耐性与SOD，POD，CAT和MDA的关系未见报道。本研究2品种结果表明：‘Sun stone’在失水胁迫期间有较强的保水能力，而‘Sunny leonidas’有较强的复水能力，即较强的失水胁迫耐性。通过测定失水胁迫后膜脂过氧化反应，‘Sunny leonidas’的花瓣和叶片MDA含量稍高于‘Sun stone’，但花瓣中SOD, POD和CAT酶活性相比对照增加的幅度，均高于‘Sun stone’失水胁迫后花瓣中3种酶增加的幅度，而瓶插期间‘Sunny leonidas’花瓣和叶片的MDA含量均低于‘Sun stone’，SOD，POD和CAT酶活性高于‘Sun stone’，且3种酶的高峰均出现在瓶插寿命结束前1天，即瓶插第4天，比‘Sun stone’花瓣中3种酶的高峰晚1天出现。这表明失水胁迫对‘Sunny leonidas’花瓣的膜损伤大于‘Sun stone’，复水后‘Sunny leonidas’的细胞内自身维持活性氧代谢平衡的能力强于‘Sun stone’，这与前面结果相吻合。2品种失水胁迫后瓶插期间叶片的SOD，POD和CAT 3种酶活性与对照差异不显著，这表明24 h失水胁迫处理未造成月季切花叶片的膜损伤，月季切花的叶片比花瓣有更高的失水胁迫耐性。

以上结果可以明确:月季品种间失水胁迫耐性的差异不是与失水胁迫后花瓣中MDA含量增加的幅度相关，而是与切花复水瓶插期间的MDA含量和SOD，POD和CAT酶的活性增加幅度相关联；月季切花瓶插期间，3种抗氧化酶活性高峰的出现与花瓣衰老相关联。

3.2 月季切花品种间失水胁迫耐性与内肽酶活性和种类诱导的关联

植物失水胁迫过程往往伴随蛋白质降解，目前普遍认为植物体蛋白质的降解先是由内肽酶的作用，将蛋白质水解成小肽，再由外肽酶起作用将小肽彻底水解成氨基酸，然后这些终产物被用于贮存或运输。本试验2品种失水胁迫后，2品种花瓣的内肽酶活性变化结果，结合失水胁迫后2品种的鲜质量损失率和瓶插寿命缩短百分比的结论，表明24 h失水处理后，‘Sunny leonidas’的内肽酶活性高于‘Sun stone’，复水瓶插后‘Sunny leonidas’的自我修复能力强于‘Sun stone’，与‘Sunny leonidas’失水耐性强于‘Sun stone’结论相一致。

研究表明：植物遭受水分胁迫后，能诱导新的内肽酶产生，但诱导的内肽酶种类不仅因植物种类不同而有所差异，如在蚕豆(Jones et al., 1995)、豇豆(Khanna-Chopra et al., 1999)、小麦(吴小平等，1994；Srivalli et al., 1998)和拟南芥(Koizumi et al., 1993)等植物上，水分胁迫诱导产生的主要是巯基蛋白酶，在月季切花花瓣中诱导产生的主要是丝氨酸蛋白酶；而且诱导产生的内肽酶种类与不同失水胁迫耐性的品种间有关。对小麦的研究表明(吴小平等，1994；Srivalli et al., 1998)，在PEG渗透胁迫下，抗旱性不同的品种叶片内肽酶活性诱导升高幅度和活性组成的变化不同：抗旱品种上升幅度远小于敏感品种；2品种叶片中的内肽酶主要是巯基蛋白酶，其活性因渗透胁迫而显著提高，2品种叶片中没有检测到丝氨酸蛋白酶，其活性在敏感品种中没有因渗透胁迫被诱导，但在抗旱品种中却显著被诱导；对月季切花的研究表明(赵喜亭等，2008)，在自然失水胁迫下，耐性强的品种花瓣内肽酶活性上升的幅度远大于中度耐性品种，2品种花瓣均存在丝氨酸蛋白酶，耐性强的品种提高幅度远低于中度耐性品种。本试验研究失水胁迫对2品种叶片和花瓣内肽酶种类诱导和复水瓶插后内肽酶的变化。结果表明：失水胁迫并没有检测到新的内肽酶种类，但丝氨酸蛋白酶在失水胁迫和后期瓶插中占主导地位，变化最为剧烈，但失水胁迫耐性较强品种‘Sunny leonidas’花瓣中丝氨酸蛋白酶变化幅度明显低于‘Sun stone’，前者在瓶插第4天丝氨酸蛋白酶活性显著增加，而‘Sun stone’在瓶插第4天显著增加，与2品种失水胁迫后的瓶插寿命变化一致。

由此可见：本试验所获得的切花月季品种间失水胁迫耐性与内肽酶活性和种类之间的关联与上述农作物之间存在很大的差异，月季切花品种间失水胁迫耐性的差异与丝氨酸蛋白酶活性诱导相关联。

3.3 抗氧化相关酶活性和内肽酶活性之间的关联

水分胁迫能使植物产生各种生理生化反应，如渗透调节、光合和呼吸代谢、活性氧代谢、糖代谢、内源激素和酶系统的变化等(Barbara et al., 1998)。水分胁迫会引起小麦(崔香环等，2007)、番茄(Lycopersicon esculentum)(史庆华等，2004)、水稻(Oryza sativa)(孙骏威等，2004)等大田作物抗氧化酶的变化，清除植物体内产生的自由基；水分胁迫提高了蚕豆(Jones et al., 1995)、豇豆(Khanna Chopra et al., 1999)、小麦(吴小平等，1994；Srivalli et al., 1998)和拟南芥(Koizumi et al., 1993)等植物体内内肽酶活性，加速蛋白质水解成氨基酸。但同时对植物水分胁迫下氧化酶和内肽酶之间的关联的研究未见报道。本试验中2品种失水胁迫后，前者鲜质量损失率大于后者，研究发现品种花瓣中SOD，POD和CAT抗氧化酶活性和内肽酶活性增加有很好的同步性，而且‘Sunny leonidas’花瓣中的抗氧化酶和内肽酶活性增加幅度均大于‘Sun stone’。

这种复水瓶插期间抗氧化酶高峰早于内肽酶显著增加导致瓶插寿命结束的现象可能是植物遭受水分胁迫后，植物抗氧化防御系统立即启动，清除体内自由基以保护细胞免受伤害的同时，蛋白质在内肽酶催化下被水解，随着切花衰老，细胞内自由基不断增加，抗氧化酶活性不断增强，当自由基过量时导致抗氧化酶系统的崩溃，加速内肽酶的活性，从而导致切花衰老。至于抗氧化系统的崩溃是通过何种信号和途径来加速内肽酶活性有待进一步研究。

4 结论

采用失水胁迫后复水瓶插处理‘Sunny leonidas’和‘Sun stone’品种，以探讨品种间失水胁迫耐性与抗氧化酶和内肽酶的关系。明确了月季切花品种间失水胁迫的差异与SOD, POD和CAT活性高峰出现和内肽酶活性以及丝氨酸蛋白酶的显著增加相关联；抗氧化酶活性高峰出现和内肽酶活性的显著增加与切花瓶插寿命有良好的同步性。