牡丹(Paeonia)是我国的传统名贵花卉，被誉为“花中之王”。有花植物的花粉形态特征与花色、花型等遗传性状间存在一定的相关性，并因其稳定性、保守性和可靠性而在植物分类、系统发育、起源与演化等方面研究中得到广泛应用(柯冠武等，1994；王伏雄，1995；赵先贵等，1999；冯立国等，2007；周兰英等，2008)。本研究利用光学显微镜和扫描电镜，对36个牡丹栽培品种进行了花粉形态观察，通过比较中原牡丹品种群、西北牡丹品种群和日本牡丹品种群的花粉形态，为优良品种的亲本选配及种质资源选择提供孢粉学依据，并通过对牡丹花粉形状、大小、外壁纹饰及萌发器官等方面的研究，以期建立牡丹花粉形态的量化指标，探讨其与品种演化、分类的关系，进行品种鉴定。

1 材料与方法 1.1 材料来源

2008年4—5月和2009年4月，在洛阳市国家牡丹基因库、洛阳王城公园和隋唐植物园共采集36个牡丹栽培品种的花粉(表 1)，所选的36个品种分属于中原牡丹品种群、西北牡丹品种群和日本牡丹品种群。

1.2 试验方法

1) 光学显微镜观察测量    选取含苞待放的花蕾采集花药，将新鲜花药用硫酸纸袋带回实验室观察。制样方法参照赵先贵等(1999)。于Olympus显微镜40×物镜下测量花粉的极轴长(P)、赤道轴长(E)，计算P/E值。每种花粉至少测量20粒，取平均值。

2) 电镜制样与观察测量    选含苞待放的花蕾采集花药，将新鲜花药放入装有FAA固定液的离心管中带回，置于冰箱保存。电镜观察前，将花药进行50%，70%，90%及无水乙醇梯度脱水，用解剖针剖开花药，将花粉均匀涂于粘有双面胶的样品台上，于IB-5型粒子溅射仪中喷金镀膜，在日立S-3400扫描电镜下观察并拍照。花粉描述参考《孢粉学手册》(Erdtman，1978)、《孢粉学概论》(王开发等，1983)、《花粉的采集与利用》(蒋立科，1990)中的名词术语和定义。

3) 分析方法    取36个牡丹栽培品种的花粉作运算单位，共11个指标。性状量化方法为定量性状直接取用其数值，定性多态性状则按不同形态编号为1，2，……，n，二元性状编号为0，1(陈俊愉，2001；方丛兵，2002)，然后利用DPS分析软件进行主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析 2.1 光镜观察结果

用光学显微镜观察发现：牡丹花粉赤道面观有近球形和长球形2种形态，极面观呈三裂圆形或三裂三角形；花粉以单粒形式存在，有3条萌发沟，长几达两极，属于Erdtman(1978)NPC分类系统中的N3P4C5类型。供试品种中，极轴长(P)24.19~33.20 μm；赤道轴长(E)21.06~27.92 μm；P/E1.06~1.35(表 2)。

2.2 扫描电镜观察结果

1) 花粉外壁纹饰    牡丹花粉表面纹饰的基本类型有粗网状、网状、穴网状、穴状、小穴状及脑纹穴状(图 1)。供试品种中，外壁纹饰网眼形状多为圆孔或不规则多边形，网眼的大小、分布密度及形态特征在品种间有一定的差异；网孔直径为238~942 nm，网脊为231~685 nm。除了网纹较特殊的‘岛锦’和‘粉黛三千’2个日本品种外，网脊宽度基本与网孔直径成反比。

2) 花粉萌发孔结构    所有供试品种花粉均具三拟孔沟，等间距环状分布在花粉表面。沟长几达两极，变化范围为16.70~24.54 μm。萌发沟两极窄中间宽，边缘明显增厚，呈裂口状，萌发沟中有米粒状颗粒，在赤道中部萌发沟凸起(如‘黑龙锦’、‘雪桂’等)，凸起部分颗粒大且稀疏，部分品种凸起不明显(如‘腈红’、‘蓝芙蓉’等)(图 2)。

3) 花粉形态    扫描电镜观察部分品种结果(图 3)显示，36个供试品种的极面观呈三裂圆形和三裂三角形2种形态。呈三裂圆形的品种有22个，其中中原品种9个，西北品种5个，日本品种8个；呈三裂三角形的品种有14个，其中中原品种5个，西北品种5个，日本品种4个。

4) 各品种群花粉形态    不同品种群花粉在网孔直径、外壁纹饰及网脊宽度上均有差异。供试的13个中原品种，花粉外壁纹饰为小穴状、穴状、穴网状，以穴状居多；网孔直径较小，为238~517 nm。外壁小穴或网眼形状不规则，大小不均；网脊较粗厚，宽368~685 nm。供试的10个西北品种，花粉外壁纹饰为穴网状、网状、粗网状，以网状纹饰居多；网孔直径较大，为694~942 nm。外壁网眼多为圆形，大小均匀；网脊平滑，宽302~430 nm。供试的13个日本品种，花粉外壁纹饰为穴状、穴网状、脑纹穴状，以穴状纹饰居多；网眼多为圆形，大小均匀，网孔直径为308~561 nm，其中‘岛锦’和‘粉黛三千’的网眼为不规则多边形，且大小不均。日本品种花粉网脊宽度不均，为231~514 nm，其中脑纹穴状纹饰的品种网脊明显较窄。

2.3 牡丹花粉形态指标的主成分分析

利用DPS分析软件对供试的36个牡丹品种花粉的11个指标进行主成分分析，结果显示：在进行花粉分析时，各性状指标的重要性依次为：极轴长、沟宽、外壁纹饰类型、网孔直径、网孔均匀度、极面观形状、沟长、网脊宽、赤道面观形状、赤道轴长、P/E。综合重要性状依次为外壁纹饰特征、花粉粒大小、萌发孔特点等。

2.4 牡丹品种花粉形态的聚类分析

应用DPS系统分析软件进行Q型聚类分析(图 4)，根据遗传距离得到36个样品的聚类结果。在遗传距离L=40.164处供试牡丹品种可分为3类：第1类包括7个中原品种，4个日本品种；第2类包括6个中原品种，9个日本品种品；第3类为10个西北品种。在遗传距离L=18.569处可分为5类：第1类包括中原品种4个，日本品种1个；第2类包括中原品种3个，日本品种3个；第3类包括6个中原品种，7个日本品种；第4类包括日本品种2个；第5类为10个西北品种。在遗传距离L=76.647处，可分成2类：第1类包括13个日本品种和13个中原品种，第2类为10个西北品种。

3 小结与讨论 3.1 牡丹品种花粉形态的共性和差异

供试的36个品种的花粉均以单粒形式存在，具3孔沟，外壁纹饰为网孔状。但各品种群间花粉性状表现出明显的多样性，尤其在极轴长、赤道轴长、网脊宽和网孔直径、网孔均匀度及外壁纹饰等方面，表明花粉特征具有重要的品种群分类价值，也说明牡丹种内有较丰富的遗传多样性，可通过杂交育种、组织培养、遗传转化等育种技术创新和丰富其种质资源。

3.2 花粉形态差异在品种及种群间的应用

分析结果表明：花粉外壁纹饰、花粉粒大小、萌发孔特点的差异是利用花粉形态进行品种分类的重要参考依据。花粉形态在西北和中原品种群之间以及西北和日本品种群之间差异显著，在中原和日本品种群之间差异较小。聚类分析结果进一步证实日本品种群与中原品种群亲缘关系较近。但栽培牡丹各品种群的形成与演化有较长的历史过程，其与各野生原种之间以及品种群之间，有着复杂的关系(Towill，1981)；栽培牡丹从野生牡丹演化而来，花粉形态与野生牡丹既相似又不完全相同，野生牡丹的纹饰类型在各品种群中都有出现，反映出栽培牡丹起源的复杂性(袁涛等，2002；郭先锋等，2005)。所以本研究结论是否表明2个品种群起源于相同的野生原种尚有待研究。

3.3 不同处理方法对试验结果的影响

不同的研究者对牡丹花粉的描述有差异。席以珍(1984)的研究显示多数为长球形，少数为近球形；裴颜龙(1993)的描述为球形。不同的制样方法和花粉采集时间是造成以上差异的主要原因。本研究将新鲜花粉放入FAA固定液，逐级酒精脱水后进行电镜观察，观察结果为长球形品种占69.4%，近球形占30.6%。与席以珍(1984)的观察结果相近。

光学显微镜观察发现新鲜花粉以长球形为主，部分品种为近球形，但未经处理的花粉形状模糊，不适合作摄像观察。而滴入蒸馏水观察，图像清晰，但花粉吸水膨大，且形状多为近球形。本研究采用无水乙醇法，将新鲜花粉放在载玻片上，滴入无水乙醇，结果发现此方法与新鲜花粉观测形状近似，且图像清晰。与洪亚平(2007)的研究结果较为一致。