我国的毛竹资源极为丰富，是最主要的林业支柱产业之一。近年来，通过热解处理制取竹炭和竹醋液及其高附加值化应用的研究逐渐成为热点(徐明等，2008)，竹焦油作为毛竹热解的主要副产物，产量达10%左右，其中含有2，6-二甲氧基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚等杂酚(钱华等，2006；蒋建春等，2005)，极具开发潜力。

酚类结构的有机物如苯酚、甲酚、水杨酸通常可以作为杀菌剂使用，一些植物中分离出的酚类物质如丁香酚、厚朴酚、麝香草酚、银杏酚(吴光旭等，2004)、丹皮酚(康业斌等，2007)等因其优异的抑菌活性，已成为植物源杀菌剂开发的目标物质。孟昭礼(2004)、孟昭礼等(2007)仿银杏酚合成了具有短侧链苯酚结构的杀菌剂银泰(1-对羟基苯基丁酮)和绿帝(邻丙烯基苯酚)，用于防治植物真菌性病害，由于该产品低毒、无“三致”作用、环境友好、田间药效好，已大面积推广使用。近期竹醋液的抑菌活性开始见诸报道。Mazela(2007)研究了木焦油对木材的防腐性能，王文桥等(2005)发现竹醋液对6种作物的8种病原真菌菌丝长有良好的抑制效果，并认为竹醋液在开发杀菌剂方面具有潜力。倪春耕(2006)比较了竹醋和竹焦油的抑菌活性，发现竹焦油对菌丝生长的活性显著高于竹醋，但未明确竹焦油对孢子萌发的抑制作用、抑菌机制和抑菌成分。鉴于竹焦油的主要成分具有与“银泰”和“绿帝”相似的短侧链酚结构，探索其对植物病原真菌的抑制作用，可为将其进一步开发成新型高效的农用杀菌剂提供研究基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 竹焦油制备

控制一定条件热解毛竹粉，收集馏出物，从中分离出竹焦油，自制。用丙酮溶解、定容为10 mg·mL^-1的竹焦油丙酮溶液，装于棕色瓶中密封保存。

移取5 mL竹焦油丙酮溶液于烧杯中，加入10 mL去离子水及5滴吐温-80，在90 ℃水浴下加热，使丙酮挥发并使竹焦油乳化，移入50 mL容量瓶中并用去离子水定容，配成浓度为1 mg·mL^-1的竹焦油乳化液，置于冰箱中冷藏保存，供抑制孢子萌发和活体试验用。

1.1.2 供试病原真菌

香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)，棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)，黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)，香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)，辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)，蕃茄灰霉病菌(Boteryeis cinerea)，荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora litchii)，水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)，白菜炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)，花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii)，十字花科蔬菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，十字花科蔬菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)，稻瘟病菌(Pyricularia grisea)。以上病原菌均由本实验室分离、保存。

1.2 试验方法 1.2.1 竹焦油对供试植物病原真菌的抑制活性

1) 竹焦油对菌丝生长的抑制作用测定 采用国家农业行业标准NY/T 1156.2-2006的带毒培养基法，测定0.5 mg·mL^-1的竹焦油对14种供试植物病原菌菌丝生长的抑制作用，从中筛选出敏感菌。测定时以加入等体积丙酮为对照，每处理重复6次。

2) 竹焦油对孢子萌发的抑制作用测定 供试植物病原菌孢子采用米糠培养基培养。待孢子成熟后，用无菌水配成孢子(或孢子囊)悬浮液，调整其浓度至显微镜观察视野下有30~40个孢子(或孢子囊)。采用国家农业行业标准NY/T 1156.3-2006规定的凹玻片法，测定含药0.5 mg·mL^-1的孢子悬浮液中的孢子萌发(或孢子囊释放)抑制率。每处理重复3次。

1.2.2 竹焦油杀菌剂对水稻纹枯病菌的抑制作用及防治效果

1) 对菌丝生长的毒力 根据测定结果，选择水稻纹枯病菌作为靶标菌, 按带毒培养基法进行毒力测定。测定时，设置5个处理浓度梯度(0.062 5~1 mg·mL^-1)。取1 mL设计浓度的竹焦油丙酮溶液至直径为9 cm的培养皿中，加入10 mL已溶化的PSA培养基，充分混匀，制成带药培养基，放置3天挥发去丙酮后接菌。以加入1 mL丙酮的PSA培养基为对照处理，每处理设置6重复。计算菌落生长抑制率。将菌落生长抑制率换算成抑制机率值(y)，药剂浓度换算成浓度对数(x)，用Excel软件求出浓度对数与机率值回归方程y＝bx+a，并计算出相关系数r, EC₅₀, EC₉₀。以40%井冈霉素母药(浙江桐庐汇丰生化有限公司提供)作为参照药剂。2)对菌丝作用的显微观察 挑取水稻纹枯病菌菌块置于用少量PS培养基润湿皿底的平皿中，培养24 h后，用无菌水洗去培养基，再加入10 mL含竹焦油0.637 mg·mL^-1的PS培养基，以加入含等量无菌水的PS培养基作对照，24 h后用用德国Axioskop40型显微镜观察菌丝的变化。3)竹焦油对菌丝氧呼吸的影响 采用自行改装的Wasburg微量气体呼吸仪(图 1)测定菌丝悬浮在含竹焦油0.637 mg·mL^-1的PS培养基中的氧呼吸速率(试验温度301.0 K)。以数显微压差测定仪替代传统的U型压差计以提高数据的精确度。设置不含药的PS培养基为参照。4)防治效果测定 采用国家农业行业标准NY/T1156.5-2006推荐的蚕豆(Vicia faba)叶片法进行测定。取健壮的蚕豆植株，截取中上部枝条，将切口插于水中，以维持测定过程蚕豆叶片正常的生理功能。分别测定喷施0.098, 0.637 mg·mL^-1的竹焦油对水稻纹枯病的保护和治疗效果。每处理用30叶片，重复4次，以喷施清水为对照。处理后在28 ℃、相对湿度100%、光:暗=12:12的条件下培育。接菌72 h后调查病情，计算病情指数和相对防治效果。

1.2.3 所制竹焦油成分的GC/MS分析

仪器：气相色谱与质谱联用仪(Agilent Technologies 6890N/5973i)，色谱柱：HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，石英毛细管柱；载气：氦气(纯度>99.999%)；流速：0.9 mL·min^-1；分流比：10:1；进样口温度：260 ℃；进样量：1 μL；柱温：60 ℃(保持3 min)，以6 ℃·min^-1程序升温至260 ℃，再以10 ℃·min升至280 ℃保持30 min；溶剂延迟：3 min；色谱-质谱接口温度：290.0 ℃；扫描范围(m/z)：50~650 amu；电离能量：70 eV；离子源温度：200 ℃；四极杆温度：150 ℃。

2 结果与分析 2.1 竹焦油对供试病原真菌的抑制活性作用 2.1.1 竹焦油对菌丝生长的抑制作用

测定结果表明(表 1):在0.5 mg·mL^-1竹焦油的作用下，所有供试菌的菌丝生长速率均受到一定的抑制，其中对十字花科蔬菜菌核病菌和水稻纹枯病菌的菌丝生长抑制率均大于85 %，抑制效果最佳；蕃茄灰霉病菌、香蕉炭疽病菌、荔枝霜霉病菌和辣椒疫霉病菌的菌丝生长抑制率在60%~77%之间；对十字花科蔬菜黑斑病菌等其余8种供试菌的菌丝生长抑制率在42.8%~50.6%之间。

2.1.2 竹焦油对孢子萌发的抑制作用

由表 1可以看出: 0.5 mg·mL^-1竹焦油对稻瘟病菌孢子萌发的抑制率可达100 %；对香蕉炭疽病菌等8种病菌的孢子萌发的抑制率在71%以上。

从试验结果来看，除白菜黑斑病菌外，竹焦油对孢子萌发的抑制率均明显大于对菌丝生长的抑制率。孢子萌发是作物病害循环的起点，对孢子萌发的高抑制活性，尤其是对多循环病害(如稻瘟病菌)的孢子有强抑制活性，显示了竹焦油作为杀菌剂开发的良好前景。

2.2 竹焦油杀菌剂对水稻纹枯病菌的作用 2.2.1 竹焦油的毒力

随着药剂浓度的增加，菌落直径逐渐由大变小，抑菌率逐渐增大，且菌丝体由紧密逐渐变稀疏，菌丝逐渐出现了明显的凋萎。菌落由外缘向内逐渐枯萎而出现明显的黄化圈。毒力测定结果表明:竹焦油杀菌剂抑制水稻纹枯病菌丝生长的EC₅₀, EC₉₀分别为0.098, 0.637 mg·mL^-1(y=1.58x+6.59，r=0.982 5)，而井冈霉素的EC₅₀, EC₉₀则分别为0.347, 2.969 mg·mL^-1(y=1.46x+5.59，r=0.981 3)，说明竹焦油对水稻纹枯病菌的离体抑制效果明显高于井冈霉素。

2.2.2 对菌丝作用的显微观察

在含竹焦油0.637 mg·mL^-1的PS培养液中处理24 h后，仅存少数气生菌丝，大部分菌丝体已经凋亡。对照菌丝细胞壁光滑，生长舒展，分枝节间较长；而加药菌丝形态产生明显变异，出现细胞壁粗糙、细胞膨大、生长末端钝圆、细胞内呈絮凝状变性等特征(图 2)。

2.2.3 竹焦油对菌丝氧呼吸速率的影响

呼吸作用是细胞内能量转化的中心环节，它所释放的能量供应各种生命活动。由图 3可以看出，竹焦油对菌丝的呼吸速率有明显的抑制作用，0.637 mg·mL^-1的竹焦油处理120 min，菌丝的氧呼吸受抑制率达48.89%。

2.2.4 防治效果测定

对照处理的蚕豆叶片接种水稻纹枯病菌72 h后，叶面上出现大量褐色病斑，但喷施竹焦油再接种的蚕豆叶片仅出现零星小病斑，而接种发病后再喷施竹焦油，产生的纹枯病斑也明显比对照小。病情统计表明，竹焦油对水稻纹枯病有较好的防治作用，0.098, 0.637 mg·mL^-1的竹焦油72 h后的相对保护效果分别为33.31%, 51.18%，相对治疗效果分别为22.34%, 38.19%(表 2)，显示了竹焦油不仅具有阻止水稻纹枯病菌侵入而减少病斑数量的作用，而且能减缓病斑的扩增。

2.3 竹焦油成分的GC/MS分析结果

对本试验所用的竹焦油用GC/MS进行主要成分分析，获得的总离子色谱图中有近40个色谱峰(图 4)。将图中分离出的各组分提取质谱图, 用NIST 98标准谱库检索和相关文献资料查阅, 分别确认了24种成分。用气相色谱面积归一化定量法计算出各种成分的相对质量分数, 其定性定量结果如表 3所示。已定性的24种化合物的相对含量为81.269%, 其中酚类物质相对含量高达72.491%，远高于文献值43.63%(钱华等，2006)。酚类物质的杀菌活性可用酚系数来表示，在鉴定出的酚类物质中，苯酚、对甲苯酚、邻甲苯酚、邻甲氧基苯酚的酚系数分别为1.5, 2.5, 1.66, 1.46有相近的酚系数，对乙基苯酚的活性则是苯酚的5倍(孙君社等，1996)，而对苯二酚类对半镰刀菌的活性是苯酚的30多倍((张桂芝等，2004)。测定结果说明，本竹焦油检测样中不含醋酸、甲醇等竹醋中的固有的抑菌组分。

3 结论与讨论

1) 竹焦油对所有供试菌的菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用，是一种广谱杀菌剂，其中对十字花科菌核病菌和水稻纹枯病菌的菌丝生长、稻瘟病菌的孢子萌发抑制效果较佳。

2) 竹焦油对水稻纹枯病菌的离体抑制效果明显高于井冈霉素，它具有使菌丝细胞壁粗糙、细胞膨大、生长末端钝圆，细胞质产生絮凝的作用，能抑制菌丝生长的氧呼吸速率，活体试验中也体现出较好的防治效果。

3) 本试验制得的竹焦油中，酚类物质的含量远高于文献报道值。但竹焦油的组成、抑菌活性与热解温度、升温速率、热解氛围和热解时间等因素有关，因此有必要深入研究制备高抑菌活性竹焦油的热解工艺。此外竹焦油中的高抑菌成分、抑菌机制和田间应用效果也有待进一步研究。

4) 杀菌剂是植物病害防治的主要手段。低成本地开发高效低毒的新型杀菌剂一直都是农业领域的热点问题。近年来生物源(如植物源)活性物质杀菌剂的研究与开发目前在我国正蓬勃开展，但由于受原料来源限制，且活性物质的可变因素太多，开发成杀菌剂新剂型或得到新型活性物质前驱体并进一步开发存在很多困难。竹焦油抑菌活性强，来源广，在热解工艺稳定的前提下具有相对稳定成分，相对于化学杀菌剂(包括仿生化学合成杀菌剂)和植物源活性物质杀菌剂具有不可比拟的优势，作为一类特殊的植物源新型杀菌剂开发将具有重大的经济和社会价值。