林业科学  2010, Vol. 46 Issue (4): 49-57   PDF    
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王永清, 付燕, 杨芩, 罗楠, 邓群仙, 严娟, 曾建国, 阮光伦
Wang Yongqing, Fu Yan, Yang Qin, Luo Nan, Deng Qunxian, Yan Juan, Zeng Jianguo, Ruan Guanglun
枇杷属植物遗传多样性的ISSR分析
Genetic Diversity of Eriobotrya Analyzed by ISSR Markers
林业科学, 2010, 46(4): 49-57.
Scientia Silvae Sinicae, 2010, 46(4): 49-57.

文章历史

收稿日期:2008-12-30

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王永清
付燕
杨芩
罗楠
邓群仙
严娟
曾建国
阮光伦

枇杷属植物遗传多样性的ISSR分析
王永清1, 付燕2, 杨芩3, 罗楠1, 邓群仙1, 严娟1, 曾建国4, 阮光伦5    
1. 四川农业大学林学园艺学院 雅安 625014;
2. 黔东南民族职业技术学院植物组培中心 凯里 556000;
3. 凯里学院环境与生命科学学院 凯里 556011;
4. 成都市龙泉驿区农村发展局 成都 610100;
5. 重庆市涪陵区果品办公室 重庆 408000
摘要: 采用ISSR技术对41份枇杷属植物材料进行分类和遗传多样性研究。从100条引物中筛选出20条引物共产生436条带,其中多态性带392条,占89.9%。平均有效等位基因数为1.3,平均Nei’s基因多样性指数为0.208 5,平均Shannon信息指数为0.332 3,表明枇杷属植物中具有较丰富的遗传多样性。发现特异性条带33个,但并未发现春季开花或秋冬开花的特异标记,所用ISSR标记分析枇杷属植物的亲缘关系所得聚类结果表明,开花时期不能作为枇杷属植物的分类依据。相似系数0.722可将41份枇杷属植物分为野生类群和栽培类群,而栽培品种却不能按单一性状进行聚类。对枇杷属植物的分类方法进行讨论。
关键词:枇杷属    ISSR    分类    遗传多样性    
Genetic Diversity of Eriobotrya Analyzed by ISSR Markers
Wang Yongqing1, Fu Yan2, Yang Qin3, Luo Nan1, Deng Qunxian1, Yan Juan1, Zeng Jianguo4, Ruan Guanglun5    
1. College of Forestry and Horticulture, Sichuan Agricultural University Ya'an 625014;
2. Center for Plant Tissue Culture, Qiandongnan Nationality Professional Technology College Kaili 556000;
3. College of Environmental and Life Science, Kaili University Kaili 556011;
4. Bureau of Rural Area Development of Longquanyi, Chengdu Chengdu 610100;
5. Fruit Office of Fuling, Chongqing Chongqing 408000
Abstract: The genetic diversity of Eriobotrya was analyzed by ISSR markers. Twenty primers selected from 100 candidates were applied to the amplification which produced 436 bands. Of them 392 bands (89.9%) were polymorphic. The average effective number of alleles, Nei's gene diversity and Shannon's information index were 1.3, 0.208 5 and 0.332 3, respectively, suggesting that the accessions was comparatively great genetic diversity. There were 33 specific markers, but no specific markers for spring florescence or autumn-winter florescence were found. The spring florescence accessions could not be clustered to one group according to the dendrogram, suggesting that it might be inappropriate to use florescence as a criterion for the classification of Eriobotrya. The 41 loquat accessions could be divided into wild type and cultivated type with the similarity coefficient of 0.722, while the cultivated type could not be further classified according to a single trait. Based on the data, a discussion was made on the classification methods of Eriobotrya.
Key words: loquat(Eriobotrya)    ISSR    genetic relationship    genetic diversity    

枇杷属(Eriobotrya)植物属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae),原产中国(Lin et al., 1999),是我国主要果木类经济树种(胡芳名等,2006)。枇杷属植物约有30种,主要分布于亚洲亚热带和温带地区,其中原产于中国的有21个种(包括种、变种和变型)(林顺权等,2004)。

研究枇杷属植物遗传多样性和分类对枇杷属植物种质资源保护、遗传改良和种质创新及新品种培育具有重要意义。关于枇杷属植物遗传多样性的研究已有一些报道,但直到近年才有少量分子生物学方面的研究报道,其结论也不尽一致。例如,潘新法等(2002)孟祥勋等(2003)对不同枇杷品种的基因组DNA进行RAPD分析,结论是不同枇杷品种基因型间存在着丰富的遗传多样性;蔡礼鸿等(2005)采用等位酶和基因型指纹分析法研究普通枇杷(Eriobotrya japonica)及4个野生近缘种,也表明有丰富的遗传多样性;而Badenes等(2003)采用RAPD研究来自西班牙、日本、意大利和葡萄牙的普通枇杷材料,却发现它们的遗传多样性很窄。关于枇杷属植物分类,同样存在着争议。章恢志等(1990)根据开花时期将原产中国的枇杷属植物分为春季开花类型和秋冬开花类型,但杨向晖等(2007a)对此提出了质疑,认为以开花时期作为枇杷属植物分类的依据值得商榷。大渡河枇杷(E. prinoides var. dadunensis)的分类地位也是迄今为止悬而未决的问题。章恢志等(1990)将其定为变种,而唐蓓(1997)通过核型及过氧化物同工酶分析,认为它可能来源于普通枇杷和栎叶枇杷(E. prinoides)的杂种,杨向晖等(2007b)也支持大渡河枇杷可能是普通枇杷与栎叶枇杷的杂交种的观点。此外,传统的枇杷品种分类有依生态类型划分、依果肉颜色划分、依果型划分、依用途划分、依成熟期划分、依经济地位划分(邱武陵等,1996),Badenes等(2000)还提出将枇杷品种按地理来源分为中国类型和日本类型。因此,要澄清枇杷属植物遗传多样性和分类上存在的问题,还需要开展更多的研究。

ISSR(inter simple sequence repeats,即简单重复序列区间)利用人工合成的17~24个核苷酸重复序列作为引物,在引物的3’端或5’端加上2~4个随机选择的简并核苷酸,对传统的SSR之间的DNA序列进行扩增,而不是扩增SSR本身(Ziekiewicz et al., 1994)。与SSR相比,ISSR不需要预先获知序列信息,操作简单;不需要酶切,其成本比AFLP低;由于重复序列在基因组中是变异最快的成分,又由于ISSR的引物比RAPD的引物(10碱基)更长,可以使用更高的退火温度(45~60 ℃),所以ISSR比RAPD拥有更高的重复性和可靠性。近年来,ISSR技术已在芒果(Mangifera indica)(Eiadthong et al., 1999王家保等,2007)、梨(Pyrus communis)(Luisa et al., 2001)、葡萄(Vitis)(Moreno et al., 1998吴子龙等,2006)等多种果树上得到了广泛应用,证明其结果稳定可靠,是研究果树植物遗传多样性和种质资源鉴定的有效手段; 但在枇杷属植物中的应用仅见很少初步研究报道(Wu et al., 2006; Xu et al., 2006)。本研究运用ISSR技术对41份枇杷属植物材料进行分类和遗传多样性研究,旨在从分子水平上为澄清枇杷属植物的上述问题提供更多的依据。

1 材料与方法 1.1 材料

试验材料采自华南农业大学枇杷种质资源圃、四川省成都市龙泉驿区、四川省井研县和四川农业大学园艺植物生物技术研究中心枇杷种质资源圃,供试材料的种、品种(系)名称及原产地见表 1。采集新梢未展开的嫩叶,用冰壶保存带回实验室,置于-70 ℃冰箱中备用。

表 1 试验材料 Tab.1 The materials used in the study
1.2 DNA提取

参照刘月学等(2005)CTAB-蛋白酶K法略有改动,提取物用100 μL去离子水溶解,核酸蛋白仪测定DNA的浓度和纯度,并用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,-20 ℃保存。

1.3 引物选择

所用引物为加拿大哥伦比亚大学公布的第10套ISSR引物,由上海生物工程有限公司合成。

1.4 PCR扩增

PCR扩增总体积为25 μL,包括60 ng模板DNA,10×PCR buffer 2.5 μL,2.0 mmol·L-1 MgCl2,0.15 mmol·L-1dNTPs,0.3 μmol·L-1引物,1.5 U Taq酶。PCR反应在PTC-200型基因扩增仪(美国BIO-RAD公司)中进行。扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,退火70 s,72 ℃延伸1.5 min,40个循环后再72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳2 h,溴化乙锭染色,Syngene凝胶成像仪观察拍照。

1.5 数据统计与分析

电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板DNA互补的1对结合位点,可记为1个分子标记。每个反应重复2次,以2次重复中稳定出现的扩增带作为统计对象,有电泳带记为l,无电泳带记为0,形成0/l矩阵图输入计算机。利用NTSYSpc (2.10)软件进行分析,相似系数采用Dice系数,最后用UPGMA方法聚类(姜静等,2002)。采用POPGENE32计算有效等位基因数(Ne),Shannon信息指数(I)与Nei’s基因多样性指数(H)(Yeh et al., 1997)。

2 结果与分析 2.1 扩增结果

从100条ISSR引物中筛选出多态性效果好的20条引物用于ISSR扩增。选出的20条引物序列及其扩增结果列于表 2。供试引物共扩增出了436个DNA片段,平均每个引物获得21.8条带,其中多态性位点392个,占89.9%。扩增条带最多的引物为UBC807和UBC836,均有26条扩增带;UBC814扩增带最少,为12条。UBC856和UBC899扩增的多态性百分率最高,为100%,而UBC814扩增的多态性百分率最低,为58.3%。扩增出的DNA片段大多在200~1 500 bp。所有供试材料具有相同的主扩增带,多态性表现在次扩增带上。

表 2 ISSR分析中优选的20条引物的扩增结果 Tab.2 The amplification results of the 20 primers used for ISSR analysis
2.2 ISSR特异性标记

在本研究中,20条引物共产生了33条特异性条带,图 1为引物UBC811和UBC895对41份枇杷属植物材料基因组DNA扩增带型,表 3所列为具有ISSR特异性条带的种、品种(系)。可以看出,窄叶枇杷的特异性标记最多,为6条,其次为台湾枇杷,为5条,栎叶枇杷3条,广西枇杷2条,南亚枇杷、台湾枇杷恒春变种、香花枇杷和大渡河枇杷各1条。普通枇杷中只有部分品种(系)具特异性标记,其中‘伍桥’、‘解放钟’、‘白玉’和‘川农3号’各2条,‘洛阳青’、‘房光’、‘川农2号、‘泸州6号’和‘黄金块’各1条。此外,还观察到特异性缺失带,如窄叶枇杷在UBC880 1 000 bp、台湾枇杷在UBC815 400~500 bp、南亚枇杷在UBC841 700 bp各有1条缺失带。

图 1 引物UBC811(A)和UBC895(B)对41份枇杷属植物材料基因组DNA扩增带型 Figure 1 Banding pattern of 41 loquat accessions amplified by primer UBC811(A) and UBC895(B) 材料编号同表 1,箭头所指为特异性标记。 Accession codes refer to the samples listed in Tab. 1, and arrow-heads to specific bands.
表 3 具有ISSR特异性标记的种、品种(系) Tab.3 Species and cultivars (lines) and their ISSR specific markers
2.3 相似系数

表 4可以看出,41份枇杷属植物材料间的相似系数为0.621 6~0.910 6,平均相似系数0.770 3。其中‘伍桥’和‘长崎’之间的相似系数最大,为0.910 6;窄叶枇杷和‘房光’之间的相似系数最小,为0.621 6。野生资源与各栽培品种(系)之间的平均相似系数都较小,其中台湾枇杷与栽培品种平均相似系数最小,为0.679 8,大渡河枇杷与各栽培品种之间的相似系数最大,为0.754 8。

表 4 41份枇杷属植物材料的相似系数(材料编号同表 1) Tab.4 Similarity coefficients between pairs of 41 loquat accessions(accession codes refer to the samples listed in Tab. 1)
2.4 遗传多样性

表 5看出,同一引物组合所检测的不同位点的遗传多样性程度存在较大差异。41份枇杷材料的平均有效等位基因数为1.3,平均Nei’s基因多样性指数0.208 5,平均Shannon信息指数0.332 3;各位点遗传多样性程度也存在较大差别,Nei’s基因多样性最大值0.305 1,最小值0.138 3,Shannon信息指数最大值0.463 3,最小值0.209 7。

表 5 41份枇杷属植物材料的遗传多样性 Tab.5 Genetic diversity of 41 loquat accessions
2.5 聚类分析

图 2为41份枇杷属植物材料的ISSR聚类图。在相似系数为0.722时,可将所有供试材料分为2大类:第1类为野生资源,包括窄叶枇杷、台湾枇杷、台湾枇杷恒春变种、南亚枇杷、广西枇杷、香花枇杷、栎叶枇杷和大渡河枇杷;第2类为栽培品种。在相似系数为0.761时又可将第2类中的33份栽培品种分为4组:第1组为‘白玉’;第2组为‘早钟6号’和‘解放钟’;第3组为‘美满’、‘洛阳青’、‘红灯笼’、‘龙泉5号’和‘大五星’;第4组为‘龙泉1号’、‘川农3号’、‘田中’等25个品种(系)。

图 2 建立在ISSR数据基础上的41份枇杷属植物材料的聚类图 Figure 2 The dendrogram of 41 loquat accessions based on ISSR markers 材料编号同表 1 Accession codes refer to the samples listed in Tab. 1.
3 讨论 3.1 枇杷花期分类的可靠性

一般而言,枇杷属植物确有秋冬开花和春季开花之分(邱武陵等,1996)。然而,同样是普通枇杷的栽培品种如‘解放钟’和‘早钟6号’,在福建原产地是正常的秋冬开花,引种到云南和四川攀西干热河谷地区,则全部变成初夏(5月)开花(杨向晖,2005);而春季开花的台湾枇杷引种到四川雅安后变成了冬季开花(图 3)。本研究中所用的41份枇杷属植物材料中,属春季开花的有窄叶枇杷、台湾枇杷、台湾枇杷恒春变种、广西枇杷和香花枇杷,属秋冬开花的有栎叶枇杷、大渡河枇杷和普通枇杷中的33个品种(系)。在所选用的20条引物中未能发现春季开花或秋冬开花的特异标记,同时聚类结果也不能把春花型和秋冬开花型分开。可见,对于枇杷属植物,开花时期不宜作为分类的依据。

图 3 台湾枇杷在四川雅安冬季开花 Figure 3 E. deflexa blossoms in winter in Ya'an, Sichuan, China 2008年12月5日拍摄于四川农业大学园艺植物生物技术研究中心枇杷种质资源圃。 The photo was taken on December 5, 2008 at the Horticultural Biotechnology Research Center of Sichuan Agricultural University.
3.2 枇杷栽培品种分类

枇杷栽培品种通常可依生态类型、果肉颜色、果型、用途、成熟期、经济地位6种方法分类(邱武陵等,1996),也有提出按地理来源分为中国类型和日本类型(Badenes et al., 2000)。然而,ISSR研究表明枇杷栽培品种并不能按上述某一个因素进行聚类。如本研究中,‘川农1号’和‘川农2号’果肉颜色不同,首先聚在一起,而‘川农2号’与‘白玉’同为白肉,却相距甚远,说明本研究结果显示,果肉的颜色没有体现为分类的决定因素,只体现为影响分类的因素之一。‘大五星’与‘田中’果型相似,也不能聚在一起。而‘川农3号’与‘龙泉1号’聚在一起,是由于前者的亲本之一为‘龙泉1号’。同样,源自‘解放钟’与‘森尾早生’杂交后代的‘早钟6号’也首先与‘解放钟’聚在一起。枇杷栽培历史长,长期异花授粉,变异性高,且种植广泛,各地区种质交流频繁,使得地域阻隔减弱,原产于中国和日本的枇杷品种并不能各自单独聚为一类。由此可见,枇杷栽培品种的分类,不应该取决于单一性状或少数性状,而应该考虑多个性状的综合表现。

3.3 枇杷属植物遗传多样性

枇杷属植物在分子标记上呈现遗传多样性。例如,杨向晖(2005)对原产于中国的18个枇杷属植物进行研究,通过RAPD和AFLP 2种标记获得的多态性百分率分别为100%和97.82%;孟祥勋等(2003)用14条随机引物对11个枇杷栽培品种分析,多态性程度为84.21%;陈义挺等(2007)对65份枇杷种质资源进行RAPD分析,多态性高达100%。本研究从多态性百分率、有效等位基因数(Ne)、Nei’s遗传距离(H)和Shnnon信息指数(I)也可以看出,枇杷属植物表现出较丰富的遗传多样性。所有材料具有相同的主扩增带,说明枇杷属植物各种、品种之间具有一定同源性,其多态性主要表现在次扩增带上。结合前人研究结果,可以看出枇杷在其原产地种质资源比较丰富,具有相对丰富的遗传多样性。不同种类之间基因差异较大,可能是由于枇杷既可自花授粉又可异花授粉,杂种后代变异较大。Soriano等(2005)指出,欧洲的主栽品种虽然在植物学性状上差异较大,但SSR分析表明它们的遗传背景相当狭窄,究其原因是由于枇杷由中国经日本传入欧洲后,自花授粉几率相对较高,并且主要以芽变选育新品种,这与Vilanova等(2001)的研究结果一致。

3.4 大渡河枇杷的分类地位

大渡河枇杷的分类地位历来存在争议。一种观点认为大渡河枇杷是普通枇杷的始祖。这是建立在大渡河枇杷的生物学形态特征、花特征和同工酶分析基础上,结合贡嘎山东南坡的地理位置和气候特点做出的初步推断,认为大渡河枇杷的系统位置处于栎叶枇杷和普通枇杷之间,且略偏向于栎叶枇杷(章恢志等,1990李晓林等,1992蔡礼鸿等,2005)。另一种观点则认为,大渡河枇杷可能作为一个独立种存在,它来源于普通枇杷与栎叶枇杷的杂种,这个结论得到核型分析(唐蓓,1997)及RAPD和AFLP分析(杨向晖等, 2007b)的支持。

本研究运用ISSR对三者的遗传关系进行研究,相似系数分析表明,大渡河枇杷和普通枇杷的平均相似系数(0.754 8)处于栎叶枇杷和大渡河枇杷的相似系数(0.821 1)与普通枇杷和栎叶枇杷的平均相似系数(0.721 9)之间,这与章恢志等(1990)蔡礼鸿等(2005)唐蓓(1997)杨向晖等(2007b)分别对3种枇杷形态、花粉特征、同工酶、核型分析以及分子标记等得出的结果一致,即大渡河枇杷系统位置应在普通枇杷和栎叶枇杷之间,偏向于栎叶枇杷,是连接普通枇杷与其他枇杷属植物的纽带。ISSR谱带的叠加性分析表明,以大渡河枇杷作为待定杂种获得的叠加性最高(45.8%),而将栎叶枇杷和普通枇杷作为待定杂种,其叠加性都降低(分别为32.9%和38.1%),说明谱带的叠加是由于杂交的缘故,而不是来源于共同的祖先,这与杨向晖等(2007b)的结果相一致。此外,ISSR扩增出的特异性条带表明,栎叶枇杷和普通枇杷的特异性扩增带在大渡河枇杷中均存在(如栎叶枇杷在UBC876-200 bp、普通枇杷在300 bp和450 bp左右的特异性扩增带均在大渡河枇杷中出现),大渡河枇杷能囊括栎叶枇杷和普通枇杷的特异性条带,而后二者却不能分别囊括其他二者的特异性条带。ISSR标记是显性标记,根据后代中含有父本和母本的特异性带,可以确定杂种(王红霞等,2006),这进一步支持了相似系数与待定杂种谱带叠加性分析的结果。而唐蓓(1997)的核型分析结果也表明大渡河枇杷既有3A型(同普通枇杷),也有2A型(同栎叶枇杷),这可能是F1代自交后产生广泛分离的F2代,在F2代中出现了类似于双亲的表型。

综上所述,本研究的多方面的证据均表明,大渡河枇杷可能起源于普通枇杷和栎叶枇杷的杂种,这与唐蓓(1997)的同工酶和核型分析、杨向晖等(2007)的RAPD和AFLP分析的结果相一致。

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