林业科学  2010, Vol. 46 Issue (4): 37-42   PDF    
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钟浩, 周明兵, 白有煌, 汤定钦
Zhong Hao, Zhou Mingbing, Bai Youhuang, Tang Dingqin
毛竹Stowaway-like MITEs转座子的分离与分析
Isolation and Analysis of Stowaway-like MITEs from DNA Libraries Enriched in Phyllostachys edulis
林业科学, 2010, 46(4): 37-42.
Scientia Silvae Sinicae, 2010, 46(4): 37-42.

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收稿日期:2009-08-31

作者相关文章

钟浩
周明兵
白有煌
汤定钦

毛竹Stowaway-like MITEs转座子的分离与分析
钟浩1, 周明兵1, 白有煌2, 汤定钦1    
1. 浙江林学院 浙江省现代森林培育技术重点实验室 临安 311300;
2. 浙江大学生命科学学院生物信息系 杭州 310058
摘要: 微型颠倒重复序列(miniature inverted repeat transposable elements, MITEs)是一类对基因组进化和基因表达有重要调节作用的转座子。为分析MITEs在毛竹基因组中的分布特性,借鉴Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats (FIASCO)方法,首次构建Stowaway-like MITEs富集文库。随机挑取21个克隆,测序发现2个含有Stowaway-like MITEs序列(Stow-Ph1Stow-Ph2),阳性率为9.52%。Stow-Ph1Stow-Ph2的长度分别为260和258 bp,具有Stowaway-like MITEs典型的末端颠倒重复序列(terminal inverted repeats, TIRs)和靶位点重复序列(target site duplication, TSD)。Stow-Ph1Stow-Ph2与水稻的Stow-Os8(FJ266024)的同源性分别为46.4%和52.6%。Stow-Ph1Stow-Ph2与水稻16类Stowaway-like MITEs的TIRs前20 bp的相似性均高于50%,表明毛竹的Stowaway-like MITEs在TIRs上是高度保守的。
关键词:毛竹    磁珠富集    转座子    TIRs    Stowaway-like MITEs    
Isolation and Analysis of Stowaway-like MITEs from DNA Libraries Enriched in Phyllostachys edulis
Zhong Hao1, Zhou Mingbing1, Bai Youhuang2, Tang Dingqin1    
1. Zhejiang Key Laboratory for Modern Silvicultural Technology Zhejiang Forestry University Lin'an 311300;
2. Department of Bioinformatics, College of Life Sciences, Zhejiang University Hangzhou 310058
Abstract: Transposable elements were a kind of DNA fragments movable in genomes. Miniature inverted repeat transposable elements (MITEs) were a class of short, widespread transposable elements with high copy number which played an important role in evolution of genome and regulation of gene expression. In order to analyze the distribution and characteristics of MITEs in Phyllostachys edulis genome, DNA library enriched for Stowaway-like MITEs was firstly constructed by the method of FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats). Totally 21 recombinant clones were randomly isolated with PCR method and then sequenced. Two clones (Stow-Ph1 and Stow-Ph2) were identified as Stowaway-like MITEs. The rate of positive clones was 9.52%. The fragment lengths of Stow-Ph1 and Stow-Ph2 were 260 bp and 258 bp, respectively. They had typical TIRs (terminal inverted repeats) and TSD (target site duplication) of Stowaway-like MITEs. The identity was 46.4% between Stow-Ph1 and Stow-Os8 (FJ266024), and 52.6% between Stow-Ph2 and Stow-Os8. The identities among Stow-Ph1, Stow-Ph2 and 16 rice Stowaway-like MITEs were above 50% based on the first 20 bp of their TIRs, which reflected that the TIRs of Stow-Ph1 and Stow-Ph2 were highly conserved.
Key words: Phyllostachys edulis    enrichment by magnetic beads    transposon    TIRs    Stowaway-like MITEs    

转座子(transposable elements)是广泛分布于真核生物中的一类可移动的DNA片段。根据转座机制,可将转座子分为Ⅰ, Ⅱ2类:类型Ⅰ转座子,又称作反转录转座子(retrotransposon),其转座过程以RNA为中间媒介;类型Ⅱ转座子,又称作DNA转座子(DNA transposon),通过DNA中间体进行转座(Feschotte et al., 2002)。按转座活性的有无来划分,DNA转座子又分为自主型转座子(autonomous element)、非自主型转座子(non-autonomous element)和微型颠倒重复序列(miniature inverted repeat transposable elements, MITEs)3类。自主型转座子编码具有功能的转座酶等产物,自身能够转座;而非自主型转座子是由自主型转座子部分序列缺失后形成的,本身不具备转座活性,只有在自主型转座子存在时才能转座(Feschotte et al., 2002)。

MITEs是Bureau等(19921994)发现的一类转座子,其结构与非自主型转座子相似,但在长度上更短(100~500 bp),拷贝数更高(几百到几万),具有几十碱基左右的末端颠倒重复序列(terminal inverted repeats, TIRs)和几个碱基的靶位点重复序列(target site duplication, TSD),在自主型转座子提供转座酶的情况下能够转座(Bureau et al., 1994Wessler et al., 1995Tu, 1997)。根据TIRs和TSD的特性可以把MITEs归类成不同的家族,在植物中分布最为广泛的MITEs为TouristStowaway两大家族(Bureau et al., 1994Wessler et al., 1995Jiang et al., 2001)。水稻(Oryza sativa)的全基因组数据检索结果表明,水稻基因组中的MITEs数量多达73 459,归属于多个MITEs家族,是最丰富的转座子类型,其中,Stowaway-like MITEs有31 332个,占水稻基因组的1.6%(Oki et al., 2008)。Stowaway-like MITEs的TIRs比较保守,这为利用其TIRs保守序列作为探针分离Stowaway-like MITEs提供了可能。Stowaway-like MITEs在Tc1/mariner自主型转座子提供转座酶的情况下还能够再次转座,对基因组进化和基因表达有重要调节作用(Turcotte et al., 2001Zhang et al., 2001Feschotte et al., 2003)。

毛竹(Phyllostachys edulis)是最重要的经济竹种,大约占竹林总面积的2/3。毛竹变异(或称栽培类型)非常丰富,在秆形、秆及叶颜色上发生变异的就有龟甲竹(Ph. edulis f. heterocycla, 中国)、圣音毛竹(Ph. edulis f. tubaeformis, 湖南益阳)、方秆毛竹(Ph. edulis f. quadrangulartus, 湖南、安徽)、梅花竹(Ph. edulis f. obtusangular, 湖南岳阳)、油毛竹(Ph. edulis f. epruinosa, 安徽)、曲秆毛竹(Ph. edulis f. flexuosa, 湖南益阳)、金丝毛竹(Ph. edulis f. gracilis, 江苏南京)、黄皮毛竹(Ph. edulis f. auero-variegata, 安徽、江苏)、厚壁毛竹(Ph. edulis f. pachyloen, 江西万载、宜丰)、花毛竹(Ph. edulis f. huamaozhu, 浙江、江苏)、绿皮花毛竹(Ph. edulis f. nabeshimana, 中国、日本)、黄槽毛竹(Ph. edulis f. gimmei, 中国、日本)、绿槽毛竹(Ph. edulis f. viridisulcata, 四川)、瘤枝毛竹(Ph. edulis f. tumescen, 四川长宁、万岭)等。研究表明:多种毛竹栽培类型间的AFLP多态性很低(Lin et al., 2009),甚至没有SSR多态性(Tang et al., 2009)。多种竹子在其生长过程中表现性状不稳定,有的还会随着栽培条件的改变而发生逆转。如龟甲竹栽植后长出的新竹有的竹秆变成正常竹秆,乌角绿竹(Bambusa oldhamii)在组培过程中叶及秆的颜色也会发生变化,小佛肚竹(B. ventricosa)的秆型易受光等因子影响(陈双林等, 2001)。这些特性与转座子的遗传性类似,或许与转座子的作用存在着某种关联(与台湾植物研究院黄丽春教授个人交流)。分离和研究毛竹基因组中的Stowaway-like MITEs等转座子对揭示这些表观遗传学现象具有重要的意义。

毛竹基因组测序刚刚起步,目前还无法通过数据检索方式大量获得Stowaway-like MITEs。本研究根据Stowaway-like MITEs的TIRs保守域设计探针,借鉴Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats (FIASCO)(Zane et al., 2002)方法首次构建了毛竹Stowaway-like MITEs富集文库,成功分离并鉴定2个Stowaway-like MITEs,为研究Stowaway-like MITEs在毛竹基因组中的分布和进化特性奠定基础,也为在基因组背景比较薄弱的物种中分离MITEs提供一种新的策略和方法。

1 试验材料

毛竹叶片采集地位于浙江省临安市(30°14′N, 119°42′E)浙江林学院竹种园毛竹林,已经营5年以上。于2009年4月取毛竹新叶为材料。采集时用变色硅胶快速干燥,带回实验室后置于-70 ℃超低温冰箱中保存。

2 试验方法 2.1 基因组DNA的片段化 2.1.1 基因组DNA的提取、酶切和接头连接

采用改良的CTAB法(Doyle et al., 1987)提取毛竹基因组DNA后,取20 μL DNA(15 μg)经EcoRⅠ(宝生物工程有限公司)37 ℃酶切过夜后,在1%琼脂糖凝胶上电泳,切胶回收300~700 bp的片段。取200 ng回收的DNA和4 μL EcoRⅠ接头(5 μmol·L-1)(分别由含17个碱基的寡核苷酸序列5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′和含18个碱基的寡核苷酸序列5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′组成)通过T4 DNA连接酶(NEB公司)于16 ℃连接过夜,4 ℃保存。

2.1.2 第1次PCR

根据EcoRⅠ接头序列设计引物,上下游引物均为5′-GACTGCGTACCAATTC-3′,对连接混合液进行PCR。50 μL的PCR体系中含100 ng模板DNA,1 μL引物(10 μmol·L-1),5 μL 10×PCR Buffer,3 μL MgCl2(25 mmol·L-1),1.25 μL dNTP(各2.5 mmol·L-1),0.5 μL Taq酶(5 U·μL-1,宝生物工程有限公司),加双蒸灭菌水至总体积50 μL。反应条件: 94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共15个循环; 72 ℃延伸10 min。反应产物置于4 ℃保存。

2.2 靶向DNA片段的富集与克隆 2.2.1 生物素探针杂交

根据Stowaway-like MITEs的TIRs保守序列,合成5′端生物素标记简并性探针(5′ biotin-CTCCCTYCGTTYTTWWW TACWT-3′)。取40 μL上述PCR扩增产物和2.5 μL生物素标记探针(10 μmol·L-1),加20×SSC(0.3 mol·L-1 Na3citrate, 3 mol·L-1 NaCl, pH7.0)至总体积65 μL。PCR仪中98 ℃变性5 min,54 ℃反应30 min,取出后,缓慢冷却至室温,4 ℃保存备用。

2.2.2 链霉亲和素磁珠富集

取80 μL链霉亲和素磁珠(Dynal Biotech公司,6.7×105 Dynabeads·μL-1)置于2 mL离心管,加入1 mL TE(10 mmol·L-1 Tris-HCl, 1 mmol·L-1 EDTA, pH8.0)洗涤2次,1 mL 6×SSC(0.09 mol·L-1 Na3citrate, 0.9 mol·L-1 NaCl, pH7.0)洗涤2次。洗涤完毕后,用35 μL 6×SSC重悬磁珠,将上述生物素探针反应液加入到重悬磁珠,室温轻轻混匀30 min,使磁珠充分吸附DNA,用磁架收集磁珠,弃去杂交混合液。沉淀用1 mL 2×SSC[0.03 mol·L-1 Na3citrate, 0.3 mol·L-1 NaCl, pH7.0, 含0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)]室温下洗涤2次(每次5 min)。然后用1 mL 1×SSC(0.015 mol·L-1 Na3citrate, 0.15 mol·L-1 NaCl, pH7.0)室温下洗涤2次(每次5 min),再于45 ℃下分别洗涤2 min和5 min。将上清吸取干净,加入50 μL TE充分混匀磁珠,然后于99 ℃下水浴5 min,用磁架收集磁珠后,迅速吸取上清液。

2.2.3 第2次PCR

以上述的上清液为模板,采用第1次PCR的引物进行PCR扩增放大。反应条件与第1次PCR相同。

2.2.4 T载体连接和转化

将上述PCR扩增产物用PCR纯化试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)进行回收,连接到pMD18-T载体(宝生物工程有限公司)后,转化至DH5α感受态细胞,涂平板37 ℃过夜倒置培养。

2.3 文库的鉴定和分析

经蓝白斑筛选后,根据白斑所占的比例计算重组率。取21个白色菌落扩大培养,以菌液为模板,PCR法扩增鉴定重组子插入片段的大小(Skinner et al., 1993)。将重组子在ABI3100 Avant DNA测序仪上测序。测序得到的序列用基于隐马可夫模型(Hidden Markov Model,HMM)的HMMER软件(Eddy, 1998)进行分析,利用Juretic等(2004)建立的Stowaway profile-HMMs,鉴定Stowaway-like MITEs序列。同时通过BLAST在NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上检索水稻36类Stowaway-like MITEs,利用Vector NTI 10.0(Invitrogen公司)软件选取Clustal W方法将获得的毛竹Stowaway-like MITEs序列与水稻中的Stow-Os8进行同源性分析,另外将水稻36类Stowaway-like MITEs的TIRs和毛竹Stowaway-like MITEs的TIRs采用同样的方法进行同源性分析,利用MEGA4.0软件(Tamura et al., 2007)的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建了进化树。

3 结果与分析 3.1 DNA片段的酶切、连接和扩增

MITEs一般集中在100~500 bp,基因组DNA经EcoRⅠ酶切,回收300~700 bp的片段。接头连接后经第1次PCR,取10 μL进行电泳检测(图 1A),结果显示PCR产物明显,片段主要分布在300~700 bp,能够进行下一步试验。

图 1 富集文库的构建与Stowaway-like MITEs的分离 Figure 1 Construction of enriched library and isolation of Stowaway-like MITEs for Ph. edulis A.第1次PCR产物电泳结果PCR product of the first amplification; B. Stowaway-like MITEs富集文库及蓝白斑法筛选Enriched library for Stowaway-like MITEs and the blue white screening; C. PCR法筛选毛竹MITEs重组子The screening of MITEs recombinant clones in enriched library by PCR. M: 3 kb DNA ladder.
3.2 MITEs富集文库分析

将富集的MITEs片段与pMD18-T载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选(图 1B),LB培养基中均匀分布白色菌落为994个,占总数的99.6%。

在文库中随机挑取21个白色菌落于37 ℃培养过夜,菌液PCR检测重组子插入片段的大小(图 1C)。结果发现片段集中在500~700 bp。将这21个重组子测序,得到的序列用HMMER软件分析,发现其中有2个含有Stowaway-like MITEs序列,阳性克隆率为9.52%。分别命名为Stow-Ph1Stow-Ph2,分别对应图 1C中的5和12泳道。

目前富集文库大量测序正在进行,通过对120个克隆测序结果分析,共鉴定出11个阳性克隆,不完全数据统计结果与文库鉴定的阳性率是接近的。

3.3 毛竹Stowaway-like MITEs特性分析

Stow-Ph1Stow-Ph2的长度分别为260 bp和258 bp。Stow-Ph1的TIRs为5′-CTCCCT TCGTTTTTAAATACATGACGTTTG-3′,Stow-Ph2的TIRs为5′-CTCCCTCCGTTCTTTTTTACTT-3′,与Stowaway-like MITEs的TIRs同源。Stow-Ph1Stow-Ph2的TSD均为TA,为Stowaway-like MITEs典型的靶位点重复序列。将Stow-Ph1Stow-Ph2与NCBI上登录的Stow-Os8(FJ266024)进行同源性分析(图 2)。Stow-Ph1Stow-Ph2Stow-Os8的相似性分别为46.4%和52.6%,而Stow-Ph1Stow-Ph2之间的相似性为57.3%。

图 2 Stow-Ph1, Stow-Ph2Stow-Os8的同源性分析 Figure 2 Homologous analysis of Stow-Ph1, Stow-Ph2 and Stow-Os8 被黑色覆盖的碱基为三者的共同部分Black bases are the common part of the MITEs.

水稻基因组共有Stowaway-like MITEs 31 332个,根据TIRs保守性可分为36类(Feschotte et al., 2003),为了分析毛竹Stow-Ph1Stow-Ph2与已鉴定的36类Stowaway-like MITEs的进化关系,取36类Stowaway-like MITEs的TIRs和毛竹Stowaway-like MITEs的TIRs,通过CLUSTAL W多重序列比对后采用邻接法构建进化树(图 3)。进化树表明Stowaway-like MITEs分为5个进化枝(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ和Ⅴ),Stow-Ph1Stow-Ph2分别位于Ⅱ和Ⅴ2个进化枝中。

图 3 2个毛竹Stowaway-like MITEs和水稻36类Stowaway-like MITEs的进化关系 Figure 3 Phylogenetic relationships of 2 Ph. edulis Stowaway-like MITEs and 36 rice Stowaway-like MITEs based on TIRs
4 讨论 4.1 构建富集文库是分离MITEs的一条有效途径

毛竹2C DNA含量为4.22 pg或基因组大小为2 034 Mb,大小与玉米(Zea mays)相当,是普通二倍体栽培稻基因组的5.4倍(桂毅杰等,2007)。根据物种基因组大小与转座子含量成正比的原理(Bennetzen, 2002Feschotte et al., 2002),有理由推测毛竹基因组中也可能含有大量的转座子。但桂毅杰等(2007)随机测定996条毛竹基因组序列,平均长度926.2 bp,累计长度0.92 Mb; 重复序列分析表明,没有鉴定到Stowaway-like MITEs。本研究采用的磁珠富集法构建Stowaway-like MITEs富集文库成功分离和鉴定到毛竹基因组的MITEs。

目的DNA序列的获得主要有2种途径(孙效文等,2005):一种是经典的分子生物学方法构建含有目的DNA序列的基因组文库,通过杂交筛选出含有目的DNA序列的克隆,方法易掌握,但必须对每个克隆进行筛选鉴定,工作量大,需花费大量人力、财力,且效率较低,植物中已报道的阳性率约为1%~3%(Zane et al., 2002);另一种是从已知的核酸序列中进行数据检索,对于基因组信息相当丰富的物种而言,如水稻是有效的方法。但对于类似毛竹基因组信息相对缺乏的物种而言存在局限性。FIASCO方法首先由Tomaso Patarnello创立,广泛应用于分离基因组上含有SSR序列的片段(Zane et al., 2002)。作者也利用此法富集分离到了毛竹的SSR片段(数据未显示)。本研究首次借鉴FIASCO方法,根据Stowaway-like MITEs的TIRs保守性构建了MITEs的富集文库。在富集文库测序7 799 bp的序列中鉴定发现属于Stowaway-like MITEs的为518 bp,效率为66.419‰(表 1)。从表 1看出,在毛竹Stowaway-like MITEs富集文库中Stowaway-like MITEs的含量远大于MITEs在其他植物基因组中的含量,这说明文库的富集效果还是比较明显的。本研究创建的构建MITEs富集文库的方法将是大量分离植物MITEs的一条有效途径。

表 1 5种植物中的MITEs Tab.1 MITEs in 5 plants
4.2 毛竹Stowaway-like MITEs的TIRs在进化上相对保守

TIRs是转座子在转座过程中转座酶识别并结合的部位(Bureau et al., 19921994),Stowaway-like MITEs的TIRs序列与自主型转座子Tc1/mariner的TIRs序列非常类似,暗示Tc1/mariner能够识别Stowaway-like MITEs的TIRs,催化Stowaway-like MITEs转座。本研究鉴定的Stow-Ph1Stow-Ph2的TIRs序列与本实验室后期分离的mariner-like element转座子的TIRs相似性为71%~89%(数据未发表),Stow-Ph1Stow-Ph2与水稻的36类Stowaway-like MITEs的TIRs前20 bp的相似性都较高。表 2为在进化树5个进化枝中各取4个Stowaway-like MITEs(进化枝Ⅳ只有2个),将它们的TIRs前20 bp进行同源性分析,发现相似性均高于50%。这说明Stowaway-like MITEs的TIRs在毛竹进化过程中是相对保守的,这与其他物种的分析结果是一致的(Feschotte et al., 2003)。

表 2 Stowaway-like MITEs的TIRs同源性分析 Tab.2 Homologous analysis of the TIRs of Stowaway-like MITEs

MITEs在植物基因组中广泛大量存在,对研究植物,特别是多配体大基因组植物的基因组进化具有重要意义(Wessler et al., 1995);同时MITEs具有高拷贝数、高多态性的特点,可开发为高效多态遗传标记(Monden et al., 2009);MITEs还时常与基因相伴,一些基因的调节区域来源于MITEs,MITEs在生物或非生物胁迫下能够活跃转座(Kikuchi et al., 2003),为基因的分离和分子标签的开发提供了便利。因而MITEs在开发新型的遗传学研究工具上呈现诱人前景。目前MITEs研究的进展迅速,但是鉴定的MITEs仍然十分有限。本研究为大量分离和鉴定基因组尚未测序的物种的MITEs进行了首次成功尝试,为从表观遗传角度研究毛竹在栽培过程变化现象的分子机制奠定一定的基础。

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