我国于1979年首次在辽宁省丹东市发现美国白蛾(Hyphantria cunea)后，害虫扩散蔓延到山东、陕西、河北、天津和上海。美国白蛾繁殖量大，寄主植物种类繁多，扩散速度快，暴发时常食尽叶片。近年来美国白蛾传入了北京，对首都园林绿化及生态环境安全造成了严重影响(杨忠岐等，2007)。Ozaki等(2001)通过比较日本不同地区与原产地佛罗里达州美国白蛾种群的DNA序列后发现，美国白蛾在日本化性的变异是由于适应日本不同地区气候的进化反应，而非来自美国不同气候地区的种群。美国白蛾入侵中国近30年来，我国学者对它的适应性、性信息素、对寄主的选择、天敌、预测预报和防治方法等进行了广泛研究(季荣等，2003; 魏建荣，2003)，但对它的入侵机制及不同入侵地区的种群遗传变异等相关的研究还未见报道。随着分子生物学技术的兴起及日臻成熟，各种分子遗传标记技术不但能揭示相似姊妹种之间的差异，还有助于揭示物种的起源和进化规律(Patricia et al., 1998; Roderick，1996; Zhang，2004)。

作为遗传标记方法之一的SSR技术，其原理是每个物种的重复单位的碱基组成及拷贝数存在很大差异，具有检测敏感、共显性、多态性好等优点(Kruglyak et al., 1998; Valdes et al., 1993)。近年来，SSR技术在鳞翅目昆虫中的应用研究已有不少报道(吉亚杰等，2004; 张云武等，2001)，而美国白蛾的相关研究报道较少。由于SSR技术也是基于PCR的一种标记，其反应条件易受各种因素的干扰，如模板DNA、TaqDNA聚合酶、dNTP以及Mg²⁺的浓度等因子的条件不适合，则导致图谱弥散状背景的产生、扩增产物的消失等，这些现象都影响SSR的扩增结果，从而影响整个试验结果。为此本文以美国白蛾沧州种群为试材，对各因子的最佳反应条件进行研究，以期建立一套适合美国白蛾的SSR反应体系。

1 材料与方法 1.1 材料

2008年5月自沧州地区随机采集美国白蛾虫蛹，室内羽化后在-20 ℃下保存。

1.2 方法

1) DNA的提取 根据经典的SDS-DNA提取法，对部分操作过程进行了优化(姜静，2003)。主要改进之处:剪去枪头的尖端，蛋白酶K终质量浓度400 μg·mL^-1，RNase终质量浓度100 μg·mL^-1，0.8%的琼脂糖凝胶检测。

2) SSR-PCR反应体系 在25 μL SSR-PCR反应体系中，加入0.40 mmol·L^-1 dNTP，2.5 mmol·L^-1 MgCI₂，2.0 U Taq聚合酶，0.52 μmol·L^-1引物，30~60 ng模板DNA，用重蒸水调整体系终体积为25 μL。用dNTP、Mg²⁺、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA当中任1种成分进行浓度梯度试验时，其他成分浓度不变。引物序列参照文献(Ji et al., 2005)，由上海生物技术工程有限公司合成。dNTP和TaqDNA聚合酶均购自海泰克生物技术有限公司(表 1)。

3) SSR-PCR扩增程序 8对SSR引物(表 1)的退火温度梯度设置分别为50，50.5，51，51.5，52 ℃; 反应程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性20 s，退火30 s，72 ℃延伸15 s 35个循环，最后在72 ℃延伸2 min。PCR仪为ABI-2720型。

4) PCR产物的检测 配制8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，取扩增产物4 μL加1 μL 6倍上样缓冲液混匀、上样，恒压230 V，2 h。标准分子量标记为100 bp DNA Ladder。

电泳结束后将胶剥下，双蒸水冲洗2次、每次10 s; 加0.2%硝酸银染色液，摇床轻摇20 min; 双蒸水冲洗2次、每次10 s; 加150 mL显色液，轻摇5~7 min，即可见清楚条带显现，照相保存。电泳分析使用君意DYC-30型电泳仪及君意DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽。

2 结果与分析 2.1 dNTP浓度对SSR反应的影响

图 1泳道1~4显示了4个浓度(0.1，0.2，0.4，0.6 mmol·L^-1)的PCR扩增产物情况。虽均有扩增产物，但浓度为0.10 mmol·L^-1时PCR产物的产量极低，几乎无扩增谱带; 浓度为0.20，0.40和0.60 mmol·L^-1时均有扩增谱带，但过量的dNTPs会与聚合酶竞争结合Mg²⁺，抑制PCR反应。通过比较，0.40 mmol·L^-1时扩增带最清晰稳定，而且条带整齐，故dNTP的浓度以0.40 mmol·L^-1为宜。

2.2 Mg²⁺浓度对SSR反应的影响

Mg²⁺浓度在SSR反应中也非常重要，它是PCR中DNA聚合酶的活性所必需的辅助因子，因此其浓度在每一引物与模板配对中均应达最适量。图 2中泳道1~4显示了Mg²⁺的4个浓度1.5，2.5，3.5，4.0 mmol·L^-1的扩增结果，由于当Mg²⁺浓度为1.5 mmol·L^-1时扩增产物条带模糊，浓度为3.5和4.0 mmol·L^-1时背景加深，只有2.5 mmol·L^-1时扩增谱带清晰且稳定。

2.3 TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA对SSR反应的影响

TaqDNA聚合酶浓度过低则合成产物量减少，浓度过高可引起非特异性产物的扩增。图 3显示了不同TaqDNA聚合酶的浓度的PCR扩增产物情况。因TaqDNA聚合酶浓度为0.5 U时条带模糊不清，为2.0, 3.0 U时易出现非特异性条带，只有为1.0 U时谱带清晰、且无非特异性产物的扩增，扩增效果最好。

同理，当引物浓度为0.52和0.72 μmol·L^-1时，背景加深、条带不清，因此只有0.32 μmol·L^-1为引物优化浓度(图 4); 模板DNA在30，60 ng时谱带基本稳定且带型清晰，浓度低时条带模糊不清, 过高则背景加深、较难分辨(图 5)。

2.4 PCR反应过程中退火温度对扩增结果的影响

退火温度是决定引物与模板结合的另一重要因素，研究表明(图 6)退火温度较低时无扩增条带或多为非特异性条带，只有52.0 ℃为AF04的最佳退火温度。其他引物的最佳退火温度见表 2。

2.5 SSR-PCR优化体系的应用

选引物DH12，按照dNTP的Mg²⁺、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度分别为0.40 mmol·L^-1, 2.5 mmol·L^-1, 1.0 U, 0.32 μmol·L^-1, 30~60 ng，退火温度为50.0 ℃进行5个不同入侵地的美国白蛾种群的SSR扩增，图 7表明该SSR-PCR反应体系的优化条件能扩增出清晰、多态性高的谱带，能够阐明美国白蛾不同侵入地间种群的遗传变异和多态性。

同样用引物DH12对沧州美国白蛾种群中的17个个体进行PCR扩增，由图 8可知该引物也能扩增出清晰、多态性高的谱带。表明上述SSR-PCR反应体系稳定可靠。

3 讨论

SSR具有稳定性、共显性和多态性等优点，是一种较为理想的分子标记技术。但在实际应用中，必须对每个微卫星位点的两翼序列有针对性地设计引物。一个全新引物的设计，对试验技能要求高，成功率较低(Zhang，2004; 姜静，2003); 获得引物较为便捷的方法是检索GenBank、EMTBL或DDBJ DNA序列数据库，参考相关资料进行改进设计。

微卫星标记在鳞翅目昆虫种群遗传学研究中有不少报道，Zhang D X(2004)研究发现鳞翅目粉蝶和蛾类昆虫基因组的微卫星侧翼序列高度保守，认为这可能是鳞翅目昆虫微卫星丰富度较低的原因。Meglecz等(2007)通过对32种昆虫的微卫星序列的研究也证实不同物种之间微卫星位点的侧翼序列差异很大。本研究采用与美国白蛾同一鳞翅目的家蚕(Bombyx mori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、马尾松松毛虫(Dendrolimus punctatus)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等昆虫(Ji et al., 2005; Li et al., 2005; Grasela et al., 2005; 李竞等，2005; 沈利，2004; 王少丽等，2003; Reddy et al., 1999)已有报道的多态性表现好的引物，建立了适合研究美国白蛾的SSR反应体系，但并不是在鳞翅目昆虫上多态性表现好的引物对研究美国白蛾都适用，例如家蚕的7对微卫星引物就不能成功应用美国白蛾的遗传研究，用马尾松毛虫筛选出的8对引物在美国白蛾遗传研究中可以得到较好的扩增其主要原因可能是微卫星高度保守的侧翼序列所致(李竞等，2005; 沈利，2004; 王少丽等，2003)。

虽然SSR技术在其他昆虫上己经有了很多应用，但是不同的昆虫具有不同的最适宜体系，因而筛选SSR引物及建立稳定的反应体系是SSR多态性标记成功应用的基础。在SSR优化的体系中，过量的dNTPs会与聚合酶竞争结合Mg²⁺、抑制PCR反应。其他成分的浓度过高则会引起引物与模板的错配，产生非特异性扩增; 过低会影响PCR产物的产量，条带明显不清楚。Mg²⁺浓度也非常重要，它是PCR中DNA聚合酶的活性所必需的辅助因子，因此其浓度在每一引物与模板配对中均应做到最适。TaqDNA聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增; 浓度过低则合成产物量减少。引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机率，非特异性扩增能竞争所使用的酶、dNTP和引物，导致DNA合成产率下降。模板的质量并不需要很纯，但一定得量化，其浓度太小会影响PCR的产量，浓度太大则会产生非特异性产物或造成扩增泳道背景加深(Grasela et al., 2005)。退火温度是决定引物与模板结合的另一重要因素，实验过程中发现不同引物的最佳退火温度不同，但在本试验中引物的退火温度范围比较小，因而不需太大的变动，选用其他的引物时可以根据T_m值稍作调整, 将T_m控制在5~8 ℃。