中国森林资源持续增长，生态功能不断增强，人工林面积已占世界人工林面积的近1/3。截止到2008年, 我国人工林面积已达0.53亿hm²，森林覆盖率由新中国成立初期的8.6%提高到18.21%，人工林生态系统的健康发展亦愈显重要。关于人工林微生物的研究，目前多集中在土壤微生物和土壤理化性质等方面(Boyle et al., 2005; 孙福军等，2006; 丁玲玲等，2007); 土壤微生物区系、根际微生物区系、微生物在土壤中的生态平衡及养分转化等方面也做了深入研究(王岩等，1996; 张猛等，2003; Wasaki et al., 2005)。对于杨树(Populus)人工林生态系统中叶面、皮部和土壤中微生物区系的整体性研究工作相对较少。笔者于2007年秋至2008年夏对北京市杨树人工林4季的叶面、皮部和土壤微生物区系进行了初步分析:对杨树人工林中可培养的细菌区系和真菌区系进行了定量和定性的分析。通过对3种杨树(北京)城市人工林微生物区系的比较分析，为杨树城市人工林微生物区系和微生物多样性的研究提供基础数据，为进一步探索微生物与城市人工林生态环境的稳定、健康之间的相互关系提供依据。

1 研究区域概况

北京地处亚欧大陆东岸的暖温带半湿润地区，属大陆性季风气候，具有明显的暖温带、半湿润大陆性季风的特点。春季干旱多风，夏季炎热多雨，秋季凉爽湿润，冬季寒冷干燥，风向有明显的季节变化，冬季盛行西北风，夏季盛行东南风。年平均气温11.5 ℃。年平均降水量609 mm左右。无霜期约180~200天。本研究地点分别位于北京市温榆河南岸40°07′N, 116°28′E 108杨(Populus × euramericana cv.‘Guariento’)、北七家40°07′N, 116°28′ E 107杨(P.×euramericana cv. ‘Neva’)样地和机场路旁40°01′N, 116°32′E毛白杨(P.tomentosa)样地。所选取的人工林地属于典型的杨树人工林地，其树种单一，偶见少量杂草和灌木，枯落物也不很丰富。

2 材料与方法 2.1 样品的采集

样品采集:于2007年10月—2008年10月间，随机以S形5点取样对试验样地中叶面、皮部和土壤样品分别取样(取样间隔时间为3个月)。叶面微生物的采集:采集样地中杨树的叶片样品，放入聚乙烯袋带回实验室4 ℃冰箱保存。皮部微生物的采集:采集样地中杨树的皮部(约1.5 m高度)样品，放入聚乙烯袋带回实验室4℃冰箱保存。土壤微生物的采集:取样地中杨树林地的土壤样品500.00 g(取样深度0~20 cm)，放入聚乙烯袋带回实验室4 ℃冰箱保存。

2.2 微生物的分离和纯化

分离和纯化培养基:细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马丁氏-孟加拉红培养基和PDA培养基。

分离和纯化方法: 1)称取30.0 g叶片(树皮)加入到含有玻璃珠和270 mL无菌水的三角瓶中，摇床震荡30 min作为稀释用样液; 2)称取10.0 g鲜土加入到盛有玻璃柱和90 mL无菌水的三角瓶中，摇床震荡30 min作为稀释用样液; 3)土壤芽孢杆菌分离时，将土壤悬液在80 ℃水浴处理15 min，杀死营养细胞。最后采用稀释平板涂抹法进行分离(中国科学院南京土壤研究所，1985)。

细菌和真菌的稀释度依次以10^-3~10^-5和10^-2~10^-4接种，每个处理重复3次。分别在30和28 ℃条件保湿培养2天和5~7天后统计菌落数。细菌在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线纯化、编号贮备; 真菌在马丁氏-孟加拉红培养基平板上用点植法纯化、编号贮备。经纯化后的各微生物分别接种于上述培养基的试管斜面，置4 ℃的冰箱保存并及时进行鉴定。

叶面/皮部微生物数量(cfu·g^-1 fresh weight)=菌落平均数×稀释倍数×10;

土壤微生物数量(cfu·g^-1 dry weight)=菌落平均数×稀释倍数×10/(1-含水量百分数)。

2.3 微生物优势种群的鉴定

将分离、纯化的细菌和真菌计数后，统计各菌种优势种群的菌落数量，并挑取已纯化的优势种群单菌落进行鉴定。

2.3.1 细菌的鉴定

细菌优势种群主要通过16S rDNA分析、辅助形态学分析和BIOLOG方法进行鉴定。细菌16S rDNA分析:采用通用引物27f/1495r，扩增片段的大小为1.5 kb，测序结果与GenBank比对分析。形态鉴定及生理生化试验:革兰氏染色、芽孢染色、接触酶试验、V-P试验、M-R试验和柠檬酸盐生长试验。BIOLOG鉴定(Micro Station型，美国Biolog公司):参照说明书操作。

2.3.2 真菌的鉴定

形态鉴定:培养性状和显微性状的观察。真菌18S rDNA(ITS区)分析:采用通用引物ITS1/ITS4，扩增的长度约600 bp，测序结果与GenBank进行比对分析。

2.4 数据处理

对试验所得微生物数量和优势种群采用SPSS统计软件进行双因素方差分析。

3 结果与分析 3.1 北京市杨树人工林微生物数量变化和优势种群动态变化 3.1.1 不同林分杨树人工林内细菌数量的变化

如表 2所示: 1)叶面细菌的数量在3种林分间的变化为: 107杨>108杨>毛白杨。叶面细菌数量4季的变化分别为: 108杨，夏>秋>春; 107杨，夏>秋>春; 毛白杨，夏>春>秋(冬季叶片凋落，未采集到叶面细菌)。2)皮部细菌的数量3种林分间的变化为: 107杨>毛白杨>108杨。皮部细菌数量4季的变化为: 108杨，夏>春>冬>秋; 107杨，秋>夏>春>冬; 毛白杨，春>夏>冬>秋。3)土壤细菌的数量3种林分间的变化为: 108杨>107杨>毛白杨。土壤细菌数量4季的变化为: 108杨，秋>春>冬>夏; 107杨，冬>秋>春>夏; 毛白杨，冬>春>秋>夏。3种林分夏季土壤细菌的数量较为接近。

3.1.2 不同林分杨树人工林内真菌数量的变化

如表 3所示: 1)叶面真菌的数量在3种林分间的变化为: 107杨>毛白杨>108杨。叶面真菌数量4季的变化分别为: 108杨，秋>夏>春; 107杨，秋>夏>春; 毛白杨，夏>秋>春(冬季叶片凋落，未能够采集到叶面真菌)。2)皮部真菌的数量在3种林分间的变化为: 107杨>108杨>毛白杨。皮部真菌数量4季的变化分别为: 108杨，秋>夏>冬>春; 107杨，秋>夏>冬>春; 毛白杨，春>秋>夏>冬。3)土壤真菌的数量在3种林分间的变化为: 108杨>毛白杨>107杨。土壤真菌数量4季的变化分别为: 108杨，秋>春>冬>夏; 107杨，秋>春>冬>夏; 毛白杨，冬>春>秋>夏。3种林分在夏季的土壤真菌含量较为接近，与土壤细菌变化规律相似。

3.1.3 不同林分杨树人工林内土壤芽孢杆菌数量的变化

如表 4所示:土壤芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的数量在3种林分间差异不显著, 但随着季节的冷暖交替，其数量仍有所改变。土壤芽孢杆菌的数量在3种林分间的变化为: 108杨>107杨>毛白杨。土壤芽孢杆菌的数量4季的变化分别为: 108杨，秋>冬>夏>春; 107杨，春>秋>冬>夏; 毛白杨，春>秋>冬>夏。夏季3种林分的土壤芽孢杆菌数量均较低, 可能由于夏季炎热多雨，土壤养分散失，导致微生物所需养分减少，因而其数量降低，而其他3季土壤芽孢杆菌的数量则较高。

3.2 微生物优势种群动态变化 3.2.1 细菌优势种群动态变化

1) 叶面细菌优势种群动态变化  如表 5所示，叶面细菌优势种群的季节变化为:秋季最高，春季次之，夏季最低。在3种林分中，108杨的优势种群主要为假单胞菌(Pseudomonas sp.)、短小杆菌(Curtobacterium sp.)、微杆菌(Microbacterium sp.)、农杆菌(Agrobacterium sp.); 107杨的优势种群主要为短小杆菌(Curtobacterium sp.)、假单胞菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、泛菌(Pantoea sp.); 毛白杨的优势种群主要为短小杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌。从表 5可见，假单胞菌和短小杆菌在3种林分的秋季均有分布，且在毛白杨夏季高达81.02%。另外，短小芽孢杆菌在春季和夏季的数量也较高，尤其在107杨春季中达到了61.22%。杨树人工林中叶面细菌的优势种群以假单胞菌、短小杆菌和短小芽孢杆菌为主体。

2) 皮部细菌优势种群动态变化  如表 6所示，皮部表面细菌的优势种群数量在秋季、冬季和春季中均较高，而夏季优势种群数量则较低。108杨的皮部优势种群主要为短波单胞菌(Brevundimonas sp.)、假单胞菌、芽孢杆菌、土地杆菌(Pedobacter sp.)。107杨的皮部优势种群主要为假单胞菌、短波单胞菌、短小杆菌、土地杆菌、泛菌。毛白杨皮部的优势种群主要为短波单胞菌、假单胞菌、土地杆菌、芽孢杆菌。夏季的108杨和毛白杨中假单胞菌的数量分别高达88.76%和60.64%，可见其优势地位。枯草芽孢杆菌在3种林分中均分布在20%~30%之间，数量表现很稳定。说明它是皮部表面细菌中较稳定的类群，受环境影响不明显。杨树人工林中皮部表面细菌的优势种群以短波单胞菌、假单胞菌和土地杆菌为主。

3) 土壤细菌优势种群动态变化  如表 7所示，土壤细菌的优势种群数量在秋季中最高，春季和夏季较接近，而冬季最少。在3种林分中优势种群的数量差异不明显。108杨土壤细菌的优势种群主要为节杆菌(Arthrobacter sp.)、芽孢杆菌、金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、醋杆菌(Acetobacter sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)。107杨土壤细菌的优势种群主要为节杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌、醋杆菌。毛白杨土壤细菌的优势种群主要为芽孢杆菌、节杆菌、醋杆菌、葡萄球菌。节杆菌和芽孢杆菌在3种林分所占的百分含量在相对稳定的区间波动，分布比较均匀。醋酸单胞菌在3种林分冬季的数量尤为突出，分别在68.99%, 38.15%和47.08%。土壤细菌优势种群在3种林分中均含有芽孢杆菌、节杆菌、醋杆菌。

土壤芽孢杆菌形态鉴定结果:经革兰氏染色、芽孢染色，确定所鉴定的土壤芽孢杆菌均为阳性结果，且都存在芽孢。

土壤芽孢杆菌优势种群的季节变化为:秋＞春＞冬＞夏。结合形态鉴定、生理生化试验、16S rDNA分析和BIOLOG鉴定方式，确定土壤芽孢杆菌的主要优势种群包括:巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、简单芽孢杆菌(B. simplex)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。如表 8所示，简单芽孢杆菌在107杨冬季数量达到57.05%, 108杨夏季的数量高达56.30%，为土壤芽孢杆菌的主导优势类群。

3.2.2 真菌优势种群动态变化

1) 叶面真菌优势种群动态变化  叶面真菌优势种群的季节变化为:秋＞春＞夏。在3种林分中，108杨叶面真菌的优势种群主要为拟青霉(Bacillus thuringiensis)、杨盘二孢菌(Marssonina populi)、链格孢(Alternaria longipes)、轮枝菌(Verticillium sp.)。107杨叶面真菌的优势种群主要为杨盘二孢菌、轮枝菌、链格孢。毛白杨叶面真菌的优势种群主要为拟青霉、轮枝菌、杨盘二孢菌、链格孢。优势种群中杨盘二孢菌的分布较广泛，在3种林分的4季中均有分布，且占据了主导地位。3种林分叶面真菌的优势种群均含有杨盘二孢菌、轮枝菌、链格孢(表 9)。

2) 皮部真菌优势种群动态变化  皮部真菌优势种群的季节变化为:秋＞冬＞春＞夏。3种林分中的数量变化为: 108杨＞107杨＞毛白杨。108杨皮部真菌的优势种群主要为棘壳孢(Pyrenochaeta sp.)、小球腔菌(Leptosphaeria sp.)、小穴壳菌(Dothiorella sp.)、杨盘二孢菌。107杨皮部真菌的优势种群主要为小穴壳菌、棘壳孢、杨盘二孢菌、枝孢(Cladosporium sp.)。毛白杨皮部真菌的优势种群主要为杨盘二孢菌、小穴壳菌、棘壳孢。其中杨盘二孢菌在毛白杨的冬季和夏季分别占有82.58%和43.99%，可能毛白杨这种寄主植物的生态环境更适合于杨盘二孢菌的生长。另外，棘壳孢在四季皮部的分布也很广泛，在3种林分中几乎都可以发现，且在春季毛白杨的数量达到了53.51%，可能春季的环境条件和毛白杨这种寄主植物都比较适合其生长。须壳孢和小穴壳菌在3种林分杨树人工林的皮部也有分布，与棘壳孢和杨盘二孢菌同为皮部真菌优势种群的代表类群。3种林分共有的真菌优势种群为杨盘二孢菌、小穴壳菌、棘壳孢(表 10)。

3) 土壤真菌优势种群动态变化  土壤真菌的数量在季节间的变化为，秋季类型相对较多，春季相对较少，可能由于春季树木生长旺盛，所需养分增多，土壤中的养分调用到植物体内，固土壤中养分含量下降，导致春季土壤中真菌数量较少。在3种林分中的土壤真菌数量趋势108杨与毛白杨相似，而107杨土壤中的真菌数量相对较少。108杨土壤真菌的优势种群主要为拟青霉、黑曲霉(Aspergillus sp.)、棘壳孢、青霉(Penicillium sp.)。107杨土壤真菌的优势种群主要为拟青霉、褶皱裸胞壳(Emericella sp.)、内锈菌(Endophyllum sp.)、棘壳孢、青霉、黑曲霉。毛白杨土壤真菌的优势种群主要为褶皱裸胞壳、青霉、漆斑菌(Myrothecium sp.)、黑曲霉、内锈菌。其中褶皱裸胞壳主要分布在秋、冬季节，而青霉和曲霉则多分布在春季和夏季。3种林分共有的土壤真菌优势种群黑曲霉、青霉(表 11)。

4 讨论

1) 杨树人工林中叶面和皮部微生物的数量在107杨最高，而土壤微生物的数量在108杨最高。杨树人工林中细菌的优势种群在107杨和108杨中居多，毛白杨较少，真菌优势种群在107杨最多。杨树人工林中微生物种类变化表现为，秋季的微生物种群类型最多，除土壤微生物的季节变化不明显外，均表现为夏季的种群类型最少。原因可能是秋季植物出现第2次的生长势，叶片、枝条的伸展带动养分的运输，寄居于植物的微生物也相应得到更充足的养分，因而其数量明显增高。而夏季高温多雨，养分随雨水而流失，对寄居的微生物生态条件产生了影响，因而优势种群的数量受到了干扰相应地减少。细菌优势种群中的假单胞菌在叶面和皮部表明都含有，且占有一定的优势，说明人工林中地上部分的细菌优势种群主导类群。枯草芽孢杆菌在皮部表明和土壤中的有分布且占有较高的比例，也是优势种群中的主导类群。如以上2种细菌为指示物种，研究人工林的健康状况，可以为杨树人工林的健康提供一定的研究依据。

2) 真菌优势种群中的杨盘二孢菌在3种林分中的叶面和皮部均有分布，是植物表层的真菌代表优势种群。此外链格孢在秋季、春季和夏季叶面的分布均较多，这与杨树黑斑病的发病规律相一致, 该病主要危害毛白杨、响叶杨(P. adenopoda)、加杨(P.×canadensis)等，在高温、多湿条件下，发病快且重，雨季病害最重(向玉英，1987)。本试验毛白杨、107杨与108杨，均为黑斑病易感品种，链格孢的分布相对较广。杨盘二孢菌在皮部表面的分布也很广泛，尤其在107杨和毛白杨的秋季分布更突出，在这2种林分的秋季，溃疡病发病可能性更大。这与向玉英(1987)认为，9月下旬又有新的溃疡病病害发生，逐渐加重直到落叶的发生的规律相符。

3) 杨树与微生物的关系密切，不同杨树种类与不同的微生物之间的关系有所不同。通过对微生物的数量变化掌握健康树木和发病树木的微生物情况, 可以判别出有益微生物和有害微生物对杨树不同的作用。从毛白杨土壤微生物中筛选出对杨树溃疡病菌有拮抗作用1种链霉菌，1种芽孢杆菌(金钧然等，1989)。木霉菌对杨树皮部溃疡病菌拮抗作用的研究(高克祥等，2001)，说明某些微生物对树木的病害防治有一定的作用，可以此为基点对微生物之间的拮抗作用进行相关性的研究工作，找出若干拮抗性微生物种群，使杨树人工林能够得到健康发展，进而对城市人工林生态系统的健康发展起到促进作用。本试验由于时间、人力等因素，未能够对有益和有害微生物进行分类研究。此外，由于采样的时间选择、气候条件的不同和方法选择等因素的影响，对试验结果有一定的干扰作用，因此在同等试验、立地条件下，对杨树人工林的微生物应进一步开展区系的研究工作。