橡胶树(Hevea brasiliensis)属大戟科(Euphobiaceae)三叶橡胶树属(Hevea)，原产于南美洲北纬5°至南纬15°、西经48°至78°之间的亚马逊河流域的巴西、秘鲁、哥伦比亚、委内瑞拉和圭亚那等国。橡胶树是典型的热带树种，需要在气温较高、湿度较大、降水充沛且分布均匀以及微风的气候环境中生长。现在除亚马逊河流域的国家种植橡胶树外，泰国、印尼、马来西亚、印度等东南亚国家和中国也在种植橡胶树，其产量已占到了世界天然橡胶产量的90%以上。半个世纪以来，通过以植胶区环境类型划分、对口配置品种和抗逆(抗风和抗寒)栽培为主要基础的橡胶树北移栽培技术体系的研发与应用，使我国的天然橡胶生产从无到有，取得了突破性的发展。目前植胶业已发展成为我国热区农业的支柱性产业。

虽然橡胶树在我国北移栽培成功，但我国植胶区位于18°—24°N，处于世界植胶区的最北端，属于非传统植胶区，因此低温就成为限制我国植胶业发展的重要因素之一。低温寒害能使橡胶树非正常落叶、枝条枯死、爆皮流胶，甚至整株死亡，最终导致橡胶树正常生育期滞后，产量下降。在1975/1976年的寒害中，广东、云南、广西和福建4省区的开割橡胶树受害率达61.6%(严重受害和死亡率为10%)，幼树受害率也达到了55%(严重受害率13.4%)，其中云南全省开割树受害率达到78.2%，幼树受害率为59.5%, 产量损失为1975年干胶总产量的46%(何康等, 1987)。2007/2008年的寒害中，海南、云南和广东各植胶区又有不同程度的受害，海南垦区西北部受害较重，西南部和南部受害较轻，云南垦区减产约30 000 kg，广东垦区减产约7 000 kg¹⁾。目前橡胶树抗寒机制的研究滞后，所以抗寒育种进程缓慢，不能满足生产的需要。应用分子生物学技术研究橡胶树抗寒的分子机制，有助于丰富橡胶树的抗寒理论，正确解析其抗寒机制，促进抗寒育种的发展。

1) 中国热带农业科学院橡胶研究所产业预警研究室据历年天然橡胶自然增长率统计分析得出。

cDNA-AFLP技术与经典AFLP一样，不需要知道任何序列信息，试验操作简单，具有良好的重复性，与经典AFLP的不同之处是基因组DNA模板被由mRNA反转录的cDNA替代，这样利用cDNA-AFLP就能够全面获取转录组的表达信息。cDNA-AFLP是目前较为常用的基因差异表达分析方法。Lang等(2005)用cDNA-AFLP技术对温州蜜桔(Citrus unshiu)不同低温处理阶段的RNA进行了差异分析，找到了6个上调表达的转录衍生片段(transcript-derived fragment，TDF)，2个下调表达的TDF。Escalettes等(2006)用cDNA-AFLP技术对杏树(Prunus armeniaca)进行了分析，找到了与李痘病毒抗性相关的差异片段。Baisakh等(2006)在对盐生植物互花米草(Spartina alterniflora)的耐盐性分析中，共分离到218个差异表达的TDF，其中有14个TDF与耐盐性有关。Guo等(2006)运用cDNA-AFLP和BSA法在致病疫霉菌(Phytophthora infestans)F₁群体中找到了4个与无毒基因相关的TDF。Ma等(2007)在陆地棉(Gossypium hirsutum)中利用cDNA-AFLP找到了1个与玉米(Zea mays)T细胞质雄性不育恢复因子2同源的差异片段。Jayaraman等(2008)通过对不同谷子(Setaria italica)品种耐盐性进行cDNA-AFLP分析，找到了90个差异片段。Tian等(2009)对不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)的雄性不育突变体进行cDNA-AFLP分析，在野生型中找到了1个与育性相关的差异变段，对其全长序列的生物信息学分析表明，该基因与小孢子形成过程中的跨膜运输和信号转导功能有关。Xiao等(2008)报道了cDNA-AFLP反应体系在橡胶树中的建立，但有关该技术在橡胶树中的应用研究还未见报道。本研究从橡胶树抗寒性入手，选取11个抗寒品种和12个不抗寒品种，运用cDNA-AFLP技术对其在常温和低温胁迫下的RNA表达谱进行差异分析，旨在获取橡胶树响应低温胁迫的相关分子机制信息，为橡胶树抗寒分子育种提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

11个抗寒无性系(编号1-11)和12个不抗寒无性系(编号12-23)的芽条均取自中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃(表 1)，于2006年11月进行芽接，2007年2月装入营养袋后在大棚中正常生长，2007年5月第2蓬叶稳定后进行试验。

1.2 试验方法 1.2.1 材料处理

每个品种选取长势一致的6株苗，分A，B2组，每组3株。A组在常温下大棚中生长。B组放入人工气候箱(CONVIRON E8)，经24 h从30 ℃降到4 ℃，然后4 ℃处理48 h。人工气候箱的处理程序:温度4 ℃，湿度75%，光照强度: 5: 00—8: 00，192 μmol·m²s^-1; 8: 00—11: 00，384 μmol·m^-2s^-1; 11: 00—15: 00，575 μmol·m^-2s^-1; 15: 00—18: 00，384 μmol·m^-2s^-1; 18: 00—20: 00，192 μmol·m^-2s^-1; 20: 00—5: 00，0 μmol·m^-2s^-1。

1.2.2 总RNA的提取

橡胶树总RNA的提取参照Kiefer等(2000)的方法，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的纯度和质量。

1.2.3 cDNA双链的合成

参照Bachem等(1998)的方法进行cDNA双链的合成，分别取cDNA的第1链和第2链的合成产物5 μL，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 预扩增与选择性扩增

预扩增反应体系为20 μL，其中包括加有接头的样品10 μL，EcoRⅠ引物3.75 ng·μL^-1，MseⅠ引物3.75 ng·μL^-1，10×PCR Buffer 2 μL，MgCl₂ 2 mmol·L^-1，Taq酶0.5 U，dNTPs 0.2 mmol·L^-1，H₂O 2.9 μL。PCR扩增程序为: 72 ℃ 5 min; 94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共循环20次; 72 ℃ 2 min; 60 ℃保温30 min。

选择性扩增的反应体系为10 μL，其中包括稀释20倍的预扩增混合液2 μL，EcoR Ⅰ引物2.5 ng·μL^-1，Mse Ⅰ引物2.50 ng·μL^-1，dNTPs 0.2 mmol·L^-1，Taq酶1 U，10× PCR Buffer 1 μL，MgCl₂ 2 mmol·L^-1，H₂O 4 μL。PCR扩增程序为: 94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，66 ℃ 30 s(每次循环下降0.7 ℃)，72 ℃ 2 min，共12次循环; 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共循环28次; 60 ℃保温30 min。

扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺测序凝胶分离，银染检测，最后用GS800扫描仪记录银染结果。

2 结果与分析 2.1 橡胶树冷应答的转录组分析

用Yunyan 77-4, RRIM 600 2个模板对256个选择扩增引物组合进行筛选，从中选出100个选择扩增效果好的引物组合。用选出的100个引物组合分别对全部46个模板进行扩增，筛选差异性片段。100个选择扩增引物组合的扩增产物均分布在100~800 bp，共获得12条在不同处理中表现一致的3种类型的差异片段: 1)常温条件下表达较弱而低温胁迫处理后表达增强(图 1，2); 2)常温条件下不表达而低温胁迫处理后得到表达(图 3); 3)常温条件下表达强而低温胁迫处理后表达受到抑制(图 4)。所获得的12条差异片段均经过重复扩增得到验证，并提交GenBank EST数据库注册，注册号为GO269543-GO269554。12条差异片段特点见表 2。

2.2 抗寒相关的TDF片段分析

将12条差异片段进行克隆、测序后，在GenBank中利用BLASTn和BLASTx进行序列比对分析，12条片段中只有片段TDF5-15, TDF7-8, TDF16-10与抗逆相关基因同源, 其余9条片段，未比对到同源序列。

片段TDF5-15在橡胶树受低温胁迫后呈上调表达(图 1)。BLASTn和BLASTx比对结果表明:该片段与多种植物的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)有较高的相似性，可见该片段编码橡胶树DAHPS-like蛋白。DHAPS是莽草酸途径的第1个关键酶，它在控制分支酸合成中起着重要的作用，它的活性大小直接决定着莽草酸途径中其他低谢过程的进行，是影响芳香族氨基酸及其次生代谢物合成的一个非常关键的因素。莽草酸途径在植物中除了合成芳香族氨基酸外，还要合成芳香族氨基酸的次生代谢物如木质素、维生素E、紫草素、黄酮类等物质，这些物质与植物的抗性和育性相关。

片段TDF7-8在橡胶树受低温胁迫后呈上调表达(图 2)。BLASTn比对结果表明:该片段与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMRP3有74%相似性，与AtMRP8有71%相似性，与AtMRP7有72%相似性，与海岛棉(Gossypium barbadense)MRP-like ABC转运蛋白有77%的相似性; BLASTx比对结果表明:该片段与拟南芥AtMRP3有77%相似性，与AtMRP8有66%相似性，与AtMRP7有73%相似性，与海岛棉MRP-like ABC转运蛋白有80%的相似性，可见该片段编码橡胶树MRP-like ABC转运蛋白。ABC转运蛋白是生物体中最大的蛋白家族，大部分ABC转运蛋白结合在质膜上负责物质选择和跨膜运输，其主要功能与体内脱毒有关，包括外源物质和自身代谢毒素的排出。

片段TDF16-10在橡胶树受低温胁迫后呈上调表达(图 3)。BLASTn比对表明:该片段与大豆(Glycine max)GmWRKY39, GmWRKY62, GmWRKY19的相似性分别达到82%, 79%, 79%，与烟草(Nicotiana tabacum)NtWRKY2的相似性达到86%，与辣椒(Capsicum annuum)CaWRKY2相似性达到86%; BLASTx比对结果表明:该片段与大豆GmWRKY39, GmWRKY62, GmWRKY19的相似性分别达到88%, 81%, 86%，与烟草NtWRKY2的相似性达到82%，与辣椒CaWRKY2的相似性达到82%，可见该片段编码橡胶树WRKY-like转录因子。WRKY转录因子家族在植物受伤害、干旱、冷害及高温等非生物逆境的胁迫中起着十分重要的调节作用，其表达受伤害、干旱、冷害及高温等逆境因子诱导。

3 讨论 3.1 模拟低温寒害的可靠性

当寒潮、冷空气侵袭或空气温度骤然下降，气温降低到或低温累积达到橡胶树能忍受的温度以下时，就会发生橡胶树寒害。从寒潮特征、橡胶树的自身习性及当地环境特点3方面进行综合分析，可将橡胶树寒害类型分为平流型寒害和辐射型寒害(何康等，1987)。平流型寒害是在冷锋或静止锋长期控制下，由持久的阴冷天气、日照不足和风寒交加造成的，气温降低较缓慢; 辐射型寒害则多为急发性寒害，白天气温较高，夜间气温降得很低(植胶林地气温在5 ℃甚至0 ℃以下)，日温差一般可达15 ℃，甚至20 ℃以上。本研究中虽然人工气候箱的降温速率不可调，但仪器在默认的降温速率下经过24 h从30 ℃降到了4 ℃，温差达到了26 ℃，应该属于快速降温，因此本研究所模拟的寒害属于辐射型寒害，可以真实反映出参试材料抗辐射型寒害的能力。23份参试材料在4 ℃低温胁迫下，体内与低温相关的基因被诱导并得以表达(图 1, 2, 3, 4)，但所有材料还是全部被冻死。这也说明橡胶树的抗寒性只是表现在能耐受较高的低温，4 ℃超过了橡胶树的极限温度，所以抗寒品种和不抗寒品种在本试验中全部表现为不抗寒。

3.2 差异片段与橡胶树的抗寒性

植物在受到逆境胁迫时，磷酸戊糖代谢途径(HMP)会有不同程度加强。拟南芥在低温处理后，HMP途径代谢水平几小时内迅速增加，并持续保持(Kaplan et al., 2004; Gray et al., 2005)。而HMP代谢产生的中间产物如7-磷酸景天酮糖能进入莽草酸途径，合成芳香族氨基酸及其衍生物来提高植物的抗逆性。DAHPS是莽草酸途径中第1个关键酶，它控制分支酸合成, 其活性大小直接影响到此途径的后续代谢过程，对芳香族氨基酸及其衍生物的合成有重要的作用。王永(2006)的研究结果表明，植物在受伤或经紫外处理后，DAHPS活性有不同程度的增加，其中受伤处理对DAHPS活性影响较大。在本研究中，TDF5-15片段与DAHPS基因同源，在寒害胁迫下该基因表达量显著增加，呈上调表达，可能是由于在低温胁迫下，苯丙氨酸代谢途径增强(Guy et al., 2008)，产生木质素等与抗逆相关的代谢物质(Yazaki et al., 2001; Nair et al., 2004)，从而提高橡胶树对寒害的抵抗能力。

ABC转运蛋白是生物体中最大的蛋白家族。真核细胞中，大部分ABC转运蛋白结合于质膜上负责细胞物质的外排。MRPs蛋白属于ABC转运蛋白中MRPs亚家族，与植物在逆境下的自身解毒作用有关(Theodoulou，2000)。拟南芥AtMRP3与体内叶绿素代谢物和谷胱甘肽的接合物转运有关(Schulz et al., 2006)，AtMRP7和AtMRP8的功能还不明确。本研究中得到的差异片段TDF7-8与拟南芥AtMRP3, AtMRP7和AtMRP8同源，在低温诱导下表达量增加，可能是由于低温胁迫下橡胶树光合作用降低，细胞内叶绿素含量也下降，而且低温能使细胞对O₂的利用能力降低，多余的O₂在细胞内转变成了有毒的活性氧，需要大量的活性氧清除剂如谷胱甘肽来维持细胞正常的生理功能，因此TDF7-8编码的橡胶树MRP基因的大量表达，有助于维持细胞的光合作用和清除活性氧，从而减少低温对橡胶树的伤害，使橡胶树在低温下能正常生长。

转录调控因子WRKY基因家族是植物特有的超级基因家族。WRKY基因受干旱、伤害、冷害及高温等非生物逆境因子诱导表达。大麦(Hordeum vulgare)WRKY38基因在冷害和干旱胁迫中表达，表明其在冷害和干旱胁迫的信号转导中起调控功能(Mare et al., 2004); Huang等(2002)从欧白英(Solanum dulcamara)基因组中分离到1个编码67 ku抗冻蛋白的WRKY基因。Qiu等(2004)从水稻(Oryza sativa)基因组中克隆到13个WRKY基因，其中有10个WRKY基因受盐害、PEG、冷害及高温4种逆境因子诱导表达。本研究得到的TDF16-10片段与大豆、烟草等植物的WRKY基因高度同源，在常温下未见表达，在低温胁迫下则表达，说明该橡胶树WRKY基因受低温诱导，可能在橡胶树响应低温胁迫时起调控作用。