林业科学  2010, Vol. 46 Issue (2): 51-55   PDF    
0

文章信息

张晓英, 甘敬, 尹伟伦, 朱祯, 王华芳
Zhang Xiaoying, Gan Jing, Yin Weilun, Zhu Zhen, Wang Huafang
国槐转雪花莲凝集素基因及抗蚜性
Transformation of the Insecticidal Agglutinin Gene(gna) from Snowdrop (Galanthus nivalis) into Sophora japonica and Resistance of the Transgenic Plants to Aphids
林业科学, 2010, 46(2): 51-55.
Scientia Silvae Sinicae, 2010, 46(2): 51-55.

文章历史

收稿日期:2008-09-18

作者相关文章

张晓英
甘敬
尹伟伦
朱祯
王华芳

国槐转雪花莲凝集素基因及抗蚜性
张晓英1, 甘敬2, 尹伟伦3, 朱祯4, 王华芳3    
1. 北京市琅山苗圃 北京 100039;
2. 北京市园林绿化局 北京 100029;
3. 北京林业大学生物科学与技术学院 北京 100083;
4. 中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101
摘要: 通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因(gna)导入国槐叶片,获得转基因再生植株,经卡那霉素抗性筛选,PCR和Southern blot检测证实,gna 基因已经整合进入国槐基因组中。凝血活性检测表明,大部分转基因植株表现出一定的凝血活性,对照未转化植株的凝血活性很低。室内离体叶片虫试试验进一步证明,转基因植株较非转基因植株有一定的抗蚜虫能力。
关键词:雪花莲凝集素    槐蚜    根癌土壤农杆菌    基因转化    虫口密度    
Transformation of the Insecticidal Agglutinin Gene(gna) from Snowdrop (Galanthus nivalis) into Sophora japonica and Resistance of the Transgenic Plants to Aphids
Zhang Xiaoying1, Gan Jing2, Yin Weilun3, Zhu Zhen4, Wang Huafang3    
1. Beijing Langshan Nursery Beijing 100039;
2. Beijing Gardening and Greening Bureau Beijing 100029;
3. College of Biological Science and Biotechnology, Beijing Forestry University Beijing 100083;
4. Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences Beijing 100101
Abstract: Snowdrop (Galanthus nivalis) agglutinin (GNA) is toxic to sap sucking injurious insects of Homop teran. In this study, gna gene was successfully transformed into Sophora japonica by using the Agrobacterium tumefaciens. Tr ansgenic plants have been obtained. Kanamycin resistant test, PCR and Southern blot bioassays confirmed that gna gene was integrated into Sophora japonica genome DNA. The test about expression of gna inhibitory activity indicated that almost every transgenic plant exhibited more or less stronger ability to agglomerate red-blood cell of sheep than the non-transformed plants. Some transgenic plants were observed to have stronger resistance to aphids than the control plants in the laboratory test.
Key words: Sophora japonica    Snowdrop (Galanthus nivalis) agglutinin (GNA)    Aphis medicaginis    Agrobacterium tumefaciens    genetic transformation    insect density    

国槐(Sophora japonica),系豆科(Leguminosae)槐属植物,原产中国北方,为华北、西北地区城乡重要的绿化树种。国槐易感槐蚜(Aphis medicaginis),蚜虫刺吸汁液并分泌蜜露,影响树木的光合作用和呼吸作用,导致霉菌的产生和传播病毒,破坏城市景观。目前在国槐的栽植中,均需施用化学杀虫剂进行防治,对环境造成更严重的危害。随着全球气候的变暖,蚜虫的危害面积和危害程度也正在不断扩大并日趋严重。近年来,蚜虫已经成为国槐等豆科植物发展的重要限制因子之一。

植物凝集素是一组在储藏及繁殖器官中含量丰富、具有特异糖结合活性的蛋白质,可以透过昆虫肠壁屏障进入脂肪体、卵巢管、血淋巴中(李旭刚等,1998)。目前一般认为植物凝集素可能通过与糖蛋白,如昆虫围食膜的几丁质、消化道上皮细胞的糖缀合物、糖基化的消化酶等结合从而影响昆虫对营养的吸收,促进消化道中细菌繁殖及诱发病灶,使昆虫的生长发育受到抑制,最终达到抗虫、杀虫目的(梁辉等,2004王关林等,2004)。雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)是植物凝集素的一种,对具有刺吸式口器的害虫,如蚜虫(Aphididae)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、叶蝉(Cicadellidae)等同翅目害虫的毒杀性在转基因水稻(Oryza sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)和喂食昆虫试验上均有证实(王志斌等,1998吴昌银等,2000周岩等,1998朱新生等,1997朱玉等,1997Gatehouse et al., 1999),但未见国槐抗蚜虫基因工程育种的报道。本文通过农杆菌介导将gna基因转化国槐,获得具有一定抗蚜性的转基因植株,为国槐抗蚜新品种的培育提供了新的途径。

1 材料与方法 1.1 植物材料

所用植物材料取自北京林业大学植物生物技术学科实验室,无菌苗由国槐种子萌发后,在附加6-BA1.0 mg·L-1和IAA0.1 mg·L-1的MS(Murashige et al., 1962)培养基上进一步继代繁殖得来,苗高均为1.0 cm以上。

1.2 菌株与质粒

携带质粒pGNA(图 1)的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404由中国科学院遗传与发育生物学研究所惠赠。所含标记基因为npt Ⅱ(新霉素磷酸转移酶基因),nptⅡ和gna(雪花莲凝集素基因)分别受花椰菜花叶病毒的35S启动子控制,其T-DNA区段基因结构见图 1

图 1 pBinGNA质粒中T-DNA区段基因结构 Figure 1 Gene structure of T-DNA in the pBinGNA
1.3 农杆菌的培养

取出用于转染的保存菌种,在含有卡那霉素(Km 50 mg·L-1)与利福平(Rif 50 mg·L-1)2种抗生素的平板(YEB培养基)上划线,置于27 ℃恒温箱内培养,至长出单菌落后挑取单菌落,接种于含相应抗生素的液体YEB培养基,于27 ℃恒温下摇床培养(200 r·min-1)过夜。

1.4 叶片基因转染

取生长健壮的无菌苗叶片114枚,在预培养培养基上预培养2~3天。用叶盘法(Horsch et al., 1985)将预培养的无菌叶片,在菌液中浸染10~15 min左右,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,转入共培养培养基中于25 ℃暗培养2 ~3天后,最后将叶片转入分化筛选培养基中,25 ℃光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。叶片预培养培养基:MS+6-BA3.0 mg·L-1 + IAA 0.1 mg·L-1;叶片共培养培养基:MS+6-BA 3.0 mg·L-1+ IAA 0.1 mg·L-1 +AS 100 μmol·L-1; 叶片分化筛选培养基:MS+6-BA 3.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+G418 8 mg·L-1+Cef 500 mg·L-1; 生根筛选培养基:1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1+G418 10 mg·L-1+Cef 200 mg·L-1

1.5 PCR检测

采用CTAB法(Porebski et al., 1997)提取9株转基因植株DNA,以pBinGNA为阳性对照,以未转化植株叶片DNA为阴性对照。引物1:5′-CAA AAT GGC TAA GGC AAG TCT C CT C-3′;引物2:5′-CGG TCA TTA CTT TGC CGT CAC AAG-3′。反应体系为:94 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35个循环;最后在72 ℃下继续延伸10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 Southern blot

Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切质粒pBinGNA,从凝胶中回收约484 bp的gna基因片断为模板,采用随机引物法(α-32P)dCTP(10 μCi·μL-1)1 μL放射标记探针,取20 μg植物DNA,用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切后,在1.0%琼脂糖凝胶电泳12 h, 然后转移到NC膜上,通过预杂交、杂交后,于-70 ℃放射自显影7天,冲洗X光片并照相记录结果。

1.7 叶片蛋白提取液的凝血活性检测

取0.3~0.5 g新鲜叶片,液氮研磨后加入600 μL蛋白提取液充分混匀,以11 000 r·min-1,4 ℃离心10 min,将上清液作为检测样品;取羊血液10 mL(羊血由中国农科院畜牧研究所提供),用新鲜生理盐水配成1%柠檬酸钠溶液作抗凝剂。取抗凝剂5 mL于锥形瓶中,将采取的血液立即加入锥形瓶中,轻轻摇动,立即以1 500 r·min-1离心5 min,去上清,加3倍体积的新鲜生理盐水悬浮红血球,再以1 500 r·min-1离心5 min,去上清。同法再洗2次,收集红细胞加生理盐水配成OD540=1.0,4 ℃保存备用。取干燥的96孔血凝板1块,加检测样品20 μL,轻轻振荡。各孔加入经洗涤的红细胞80 μL,轻轻振荡静置室温(2 5 ℃)约2~4 h后观察结果。

1.8 抗蚜性检测及效果评价 1.8.1 蚜虫生殖能力

参照吴昌银等(2000)的方法并做适当的修改,在直径9 cm培养皿中放置2层滤纸,无菌水浸湿后置适量新鲜叶片,以非转化植株叶片为对照,每皿内放置3只1~2龄的槐蚜(Aphis medicaginis),重复5次,将培养皿置于恒温光照培养箱(22 ℃;光照:黑暗=14:10;相对湿度80%)。每隔24 h定时观察记录蚜虫存活、生长发育及繁殖情况,并于检查时将所蜕皮和幼蚜挑出,同时及时更换新鲜叶片直到母体蚜虫死亡为止。

1.8.2 蚜虫群体增长情况

将4株转化植株和对照植株用网罩隔开,每个植株接上5头2龄幼虫,每天定时统计蚜虫群体的数量,连续调查12天。调查指标:蚜口密度抑制率=(对照植株虫数-转化植株虫数)/对照植株虫数×100%;平均蚜口密度抑制率=各个供试植株的蚜口密度抑制率之和/供试植株数。

2 结果与分析 2.1 转gna基因国槐的获得

预培养3天的114枚国槐叶片用根癌土壤农杆菌侵染后,转接到共培养培养基3天左右,然后转移到筛选培养基上,经过2周筛选培养后,大多数叶片褪绿、变黄,有的叶片也能形成少量白色紧密的愈伤组织(图版Ⅰ-1),但在以后的筛选培养中很难分化出芽,最终变褐、坏死(图版Ⅰ-2)。只有13枚叶片从叶柄部长出愈伤组织,逐渐分化出小芽(图版Ⅰ-3, 4, 5),分化率为11.4%。将再生芽切下,插入生根培养基中,约2周后在小苗的基部生出白色根,生根率达91.7%。随后的几周产生许多须根,生长正常(图版Ⅰ-6)。当植株在生根培养基中长至4~6 cm时,移栽到小钵,置于温室,进行适宜的栽培管理(图版Ⅰ-8, 9)。

图版Ⅰ   Plate Ⅰ   1.侵染后的叶片在筛选培养基中诱导不定芽; 2.未侵染的叶片在筛选培养基中逐渐死亡: 3.不定芽在筛选培养基的诱导: 4.不定芽在光下的生长; 5.不定芽在伸长培养基中的生长; 6.不定芽在含抗生素的生根培养基中生根良好; 7.非转基因植株在含抗生素的培养基中逐渐死亡; 8, 9.转基因植株移栽后的生长情况. 1. Infected leaves induced callus in the selective medium; 2. Non-infected leaves died gradually in the selective medium; 3. Shoot induced in the selective medium : 4. Growth of shoot under the light: 5. Shoot extend induced in the medium : 6. Shoot grows well in the selective rooting medium : 7. Negative plants died gradually in the selective rooting medium : 8, 9. Transgenic plant grows well after transplanted.
2.2 国槐转化植株的Km抗性鉴定

切取生长在无菌管中转化植株的叶片,接种于含有抗生素的筛选分化培养基上,能逐渐形成愈伤组织,并能分化出不定芽,而未转化的对照植株叶片不能形成愈伤组织,叶片会逐渐变黄、发褐、坏死。初步证明转化取得成功。将对照植株顶芽切下,插入含有抗生素的生根培养基中,植株不能生根,约10天后苗基部变褐,叶片逐渐变黄,直至整株枯死(图版Ⅰ-7);而转化植株则能正常生根,生长状况良好,证明转化获得初步成功。

2.3 转化植株的PCR检测

以质粒pBinGNA的DNA作阳性对照,未转化植株叶片DNA作阴性对照,对9株转化植株进行PCR检测表明,阳性对照及转化植株扩增出了预期的484 bp的电泳带,而阴性对照没有此条电泳带(图 2),证明外源基因已整合到国槐基因组中。

图 2 转pBinGNA植株的PCR检测 Figure 2 PCR analysis of pBinGNA-transformed plants for the gna gene 1.标准分子量Molecular marker; 2.质粒pBinGNA作为阳性对照Positive control; 3.非转基因植株作为阴性对照Non-transgenic control plants. 4-12.转基因植株pBinGNA-transformed plants.
2.4 转化植株的Southern blot

取经PCR初步鉴定的植株DNA作为检测样品,以非转化植株D NA为阴性对照,将阳性质粒酶切后为阳性对照。分子杂交结果证明,质粒DNA和转化植株DNA均有杂交信号,而未转化植株DNA无杂交带(图 3)。由此可见,经Km抗性鉴定、PCR和South ern blot检测的植株是转gna植株。

图 3 国槐转gma基因植株的Southern blot分析 Figure 3 Southern assay of gna gene in transgenic plants P.质粒pBinGNA/EcoRⅠ作为阳性对照pBinGNA was digested by EcoR Ⅰ as positive control; 1.非转基因植株基因组DNA用EcoRⅠ酶切Non-transgenic control plant, genomic DNA was digested with EcoRⅠ; 2-11.转基因植株基因组DNA用EcoRⅠ酶切Transgenic plants, genomic DNA was digested with EcoRⅠ.
2.5 转化植株的凝血活性检测

提取转gna基因植株的总蛋白,稀释后作为凝集素活性的待检样品。以0.005 μg·μL-1的标准GNA蛋白为阳性对照,不加植物蛋白提取液和加未转基因蛋白提取液2个阴性对照,每孔加20 μL;接着加制备的羊红血细胞悬液80 μL,混匀25 ℃静置2 h观察结果。从转gna基因植株的凝血反应可以看出,gna基因在转基因植株中不仅存在并正常表达,当转基因植株蛋白提取物与羊血红细胞混合静置一段时间后,其中含有的GNA蛋白与羊血红细胞表面糖蛋白结合,发生凝血反应而呈混浊状态,相比之下非转基因植株蛋白提取物或转基因失活植株的蛋白提取物则不能使血红细胞凝集,最终血细胞沉积于凝血板底部。本试验中大部分转gna的国槐植株样品凝集反应比较明显,例如样品B5, B6, C1, C2, C3, D1, D3,证明gna基因在这些植株中有表达。非转化植株A1-A6中没有表达活性,证明羊血红细胞未发生凝集反应(图 4)。

图 4 转pBinGNA植株的凝血反应检测结果 Figure 4 Cruor activity analysis of pBinGNA-transformed plants for the gna gene A1-A6:非转基因植株Negative control; B1-B6:转基因植株, 大部分植株显示了较强的凝血活性, 但B2和B3活性较小 Tranformed plants, most show strong cruor activity while B2 and B3 show less activity.
2.6 转基因国槐抗蚜虫初步鉴定

取移植到营养钵3周的转基因国槐13株及未转化对照(CK)植株,分别接上2龄幼虫2头,进行孤雌生殖繁殖后代(图 5)。母体蚜虫产生的后代总数、产生后代蚜虫的时间及母体蚜虫的死亡时间的统计结果见表 1

图 5 部分转基因植株的室内抗蚜性试验 Figure 5 Aphid resistant tests in room for some transgenic plants
表 1gna基因植株室内抗蚜虫初步鉴定 Tab.1 Primary identification of resistance of leaf disc and whole p lant to aphids in gna-transgenic plants

接种蚜虫12天时统计结果表明,转化植株上的蚜口密度明显低于非转化植株,并且不同转化植株的抗蚜性存在明显差异,蚜口密度抑制率从5.6 %到44.4%不等,平均抑制率达30.3%,但单株之间存在差异,比如转基因植株T13可达44.4%,而T1的抑制率仅为5.6%(图 6)。

综合蚜虫在转基因植株叶片和幼苗上的繁殖能力和群体增长情况,与对照植株相比,转基因植株对蚜虫有一定的抑制作用。转基因植株较对照能使蚜虫的繁殖率降低,蚜口密度减少。2项调查的结果基本一致。另外,蚜虫存在多型现象,即在合适环境中,产生无翅胎生雌蚜;在环境不适时,产生有翅蚜,并且个体较大,容易死亡,而未转化植株上没有发现有翅蚜。

图 6 部分转基因植株蚜口密度抑制情况 Figure 6 Aphid density restraining results of some transgenic plants
3 讨论

在试验中发现,植物蛋白提取物和羊血红细胞最好是现制现用,采样也最好是新生叶片,否则GNA蛋白凝集活性的灵敏度就会大为下降,而不利于检测的准确性。在胰蛋白酶抑制剂活性的测定中,样品也最好是新鲜的,因为在试验中发现,放置过夜的样品在测定抑制剂活性时,转基因植株样品与对照的差异会减小。另外,本研究还发现,国槐转gna基因的部分再生植株中检测不到外源目的基因的转录产物或转录产物强弱差别很大。凝集素凝血活性表明转gna基因的部分植株没有凝血活性或仅有很弱的凝血活性,这表明这些基因在转基因植株体内发生了基因失活现象。引起外源基因失活的因素有很多种,比如多拷贝、位置效应及共抑制效应等(Flavell,1994李旭刚等,1998)。基因失活对于获得目的基因稳定表达的转基因植株是极为不利的。国槐转gna基因植株失活的机制还需进一步研究。

对于转gna基因的植物抗蚜性目前已有文献报道:转gna烟草(Hilder et al., 1995王志斌等,1998)对桃蚜(Myzus persicae)的平均抑制率为50%;周岩等(1998)报道为45%~60%;王关林等(2004)在转gna菊花(Dendranthema morifolium)的研究中,最高蚜口密度抑制率为84%;梁辉等(2004)对小麦抗蚜性的研究结果表明,转gna小麦对蚜口密度抑制率为47%。而有关木本植物转gna基因的研究未见报道。本研究结果表明,转gna基因国槐的最高蚜口密度抑制率为44.4%,平均蚜口密度抑制率为30.3%,较上述已报道植物低,初步推测可能与木本植物外源基因表达机制有关。进一步的大量抗虫试验正在进行。

参考文献(References)
李旭刚, 谢迎秋, 朱桢. 1998. 外源基因在转基因植物中的失活[J]. 生物技术通报, (3): 1-8.
梁辉, 朱银峰, 朱祯, 等. 2004. 雪花莲凝集素基因转化小麦及转基因小麦抗蚜性的研究[J]. 遗传学报, 31(2): 189-194.
王关林, 刘彦泓, 郭绍华, 等. 2004. 雪花莲凝集素基因转化菊花及转基因植株的抗蚜性研究[J]. 遗传学报, 31(12): 1434-1438.
王志斌, 李学勇, 郭三堆. 1998. 植物凝集素与抗虫基因工程[J]. 生物技术通报, (2): 5-10.
吴昌银, 叶志彪, 李汉霞, 等. 2000. 雪花莲外源凝集素基因转化番茄[J]. 植物学报, 42(7): 719-723.
周岩, 田颖川, 吴标, 等. 1998. 转雪花莲外源凝集素基因烟草对桃蚜的抑制作用[J]. 生物工程学报, 14(1): 13-19.
朱新生, 朱玉贤. 1997. 抗虫植物基因工程研究进展[J]. 植物学报, 39(3): 282-288.
朱玉, 吴茜, 高越峰, 等. 1997. 雪花莲外源凝集素基因的克隆、序列和植物表达载体的构建[J]. 农业生物技术学报, (5): 331-338.
Flavell R B. 1994. Inactive of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication[J]. Proc Natl Acid Sci, 91: 3490-3496. DOI:10.1073/pnas.91.9.3490
Gatehouse A M R, Davison G M, Stewart J N, et al. 1999. Concanavalin A inhibits development of tomato moth (Lacanobia oleracea) and peach-potato aphid (Myzus persicae) when expressed in transgenic potato plants[J]. Molecular Breeding, 5: 153-165. DOI:10.1023/A:1009681705481
Hilder V A, Powell K S, Gatehouse A M R. 1995. Expression of snowdrop lectin transgenic tobacoo plants results in added protection against aphids[J]. Transgenic Research, 4: 18-25. DOI:10.1007/BF01976497
Horsch R B, Fry J E, Hoffman N L, et al. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants[J]. Science, 227: 1229-1231. DOI:10.1126/science.227.4691.1229
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture[J]. Physiol Plant, 15: 473-497. DOI:10.1111/ppl.1962.15.issue-3
Porebski S, Bailey G, Baum B R. 1997. Modification of CTAB DNA extraction protocl for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J]. Plant Mol Biol Rep, 15: 8-15. DOI:10.1007/BF02772108