林业科学  2010, Vol. 46 Issue (2): 45-50   PDF    
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高志民, 杨学文, 彭镇华, 李雪平, 牟少华, 马艳军
Gao Zhimin, Yang Xuewen, Peng Zhenhua, Li Xueping, Mu Shaohua, Ma Yanjun
绿竹BoSUT2 基因的分子特征与亚细胞定位
Molecular Characterization and Subcellular Localization of BoSUT2 from Bambusa oldhamii
林业科学, 2010, 46(2): 45-50.
Scientia Silvae Sinicae, 2010, 46(2): 45-50.

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收稿日期:2009-07-06

作者相关文章

高志民
杨学文
彭镇华
李雪平
牟少华
马艳军

绿竹BoSUT2 基因的分子特征与亚细胞定位
高志民1, 杨学文1, 彭镇华1,2, 李雪平1, 牟少华1, 马艳军1    
1. 国际竹藤网络中心 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 北京 100102;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091
摘要: 植物蔗糖转运蛋白(sucrose transporter, SUT)作为一种功能性蛋白, 在蔗糖运输以及蔗糖特异信号感应过程中发挥着重要的生理功能。采用RT-PCR方法从绿竹中分离1个新的编码蔗糖转运蛋白基因,cDNA长1 668 bp,编码555个氨基酸,命名为BoSUT2 (注册号: EU247931)。序列分析表明,BoSUT2与其他单子叶植物的蔗糖转运蛋白有着较高的一致性,其中与绿竹BoSUT1一致性最高,达92.3%。编码蛋白二级结构预测分析显示,BoSUT2具有糖运转子保守域和跨膜结构域,属于膜蛋白。组织特异性表达检测表明,BoSUT2在叶片和叶鞘中的表达丰度较高且比较接近,在根中有微弱表达。将BoSUT2置于35S启动子之下,构建了含GFP的融合表达载体,并转化烟草悬浮细胞,观察结果表明,BoSUT2主要定位到细胞质膜上。
关键词:绿竹    蔗糖转运蛋白基因    组织特异性表达    亚细胞定位    
Molecular Characterization and Subcellular Localization of BoSUT2 from Bambusa oldhamii
Gao Zhimin1, Yang Xuewen1, Peng Zhenhua1,2 , Li Xueping1, Mu Shaohua1, Ma Yanjun1    
1. Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology of State Forestry Administration International Center for Bamboo and Rattan Beijing 100102;
2. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry Beijing 100091
Abstract: Sucrose transporter is a functional protein which plays an important role in transporting sucrose and sensing specific sucrose signals. A sucrose transporter gene, named as BoSUT2 (GenBank accession number: EU247931), has been isolated from the first strand of Bambusa oldhamii cDNA through RT-PCR method. The cDNA is 1 668 bp long and contains an open reading frame which encodes a polypeptide of 555 amino acids. The result of a homology analysis shows that the deduced BoSUT2 is highly homologous to other SUT proteins from various monocotyledonous species. The similarity with BoSUT1 from B. oldhamii is the highest, reaching to 92.3%. Secondary structure prediction analysis shows that BoSUT2 has trans-membrane domains and sucrose transporter conserved domains, which indicates that BoSUT2 belongs to membrane proteins. BoSUT2 is expressed highly in leaf and sheath, and weakly in root as shown in tissue specific expression tests. BoSUT2 gene is constructed in the GFP fusion expression vector under the control of CaMV 35S promoter; and then transferred into tobacco suspension cells. The results of subcellular localization analysis further demonstrate that BoSUT2 proteins are mainly positioned on the cytoplasmic membrane.
Key words: Bambusa oldhamii    sucrose transporter gene    tissue specific expression    subcellular localization    

高等植物中非光合器官的能量和碳源是由进行光合作用的绿色叶片提供的(Chiou et al., 1998)。大多数植物中同化物从源到库的长距离运输的主要形式是蔗糖,蔗糖为植物生长发育提供碳架与能量(Lalonde et al., 2004)。蔗糖转运蛋白(sucrose transporter, SUT)负责蔗糖的跨膜运输, 在韧皮部介导的源-库蔗糖运输以及库组织的蔗糖供给中起关键作用(白雪梅等, 2006; 戚继艳等,2007)。植物叶片通过光合作用合成的蔗糖由蔗糖运转子提供给植物生长,蔗糖合成酶(sucrose synthase, SUS)则分解由SUT运输而来的蔗糖,提供UDP-glucose给纤维素合成酶(cellulose synthase, CeS),合成细胞壁中的纤维素,SUT和SUS直接影响细胞壁中纤维素合成底物的来源。

蔗糖转运蛋白首先是在酵母中获得(Riesmeier et al., 1992),之后在马铃薯(Solanum tuberosum)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)等许多植物中相继获得。蔗糖转运蛋白基因是一个大的基因家族, 属于MFS超家族(major facilitator super-family)的蔗糖转运子(sugar transporter)亚族。目前,已从31种双子叶植物和6种单子叶植物中克隆到83个蔗糖转运蛋白基因(张立军等,2008),其中单子叶植物水稻有5个,玉米有6个,小麦有3个。对该家族基因的研究重点主要集中在不同组织部位的表达状况和基因参与糖的吸收、运输以及该基因的启动子序列分析等方面(Barker et al., 2000; Aoki et al., 2002; 马小龙等, 2009),如水稻OsSUT1的启动子在从旗叶到正在灌浆的谷粒中都有表达, 表明基因参与糖的长距离运输(Gottwald et al., 2000)。

竹子作为一种生长迅速、可再生性强的非木质植物资源,在缓解木材供需矛盾,促进生态建设和环境保护方面发挥了重要作用,其开发利用受到了国际社会的高度关注。其中竹子速生原因是人们关注的焦点之一,尽管对竹子的光合特征、材料理化性质等进行了广泛研究(郑炳松等,2001; 黄勇,2003; 贺勇等,2009),对绿竹(Bambusa oldhamii)的蔗糖合成酶(SuS)基因的分子特征和时空表达已有详细研究报道(Chiu et al., 2006),但是对竹子光合产物蔗糖在体内的运输、分配及其分子机制尚未见报道。本研究以重要的笋材两用竹种绿竹为材料,进行蔗糖运转子基因的分离,并对其进行生物信息学、亚细胞定位和组织特异性表达分析,旨在为揭示竹子体内蔗糖运输的分子机制提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 总RNA提取与cDNA合成

采用Invitrogen公司的Trizol reagent提取绿竹(源于浙江省温州)幼嫩新鲜叶片的RNA(Gao et al., 2006),用Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA。

1.2 基因的克隆

根据绿竹BoSUT1基因(DQ020217)序列设计引物SUTF: ATGGAGGAAGGCCGGAGCGATC和SUTR: TCAGTGCCCGCTGGCCACAAC,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以绿竹cDNA为模板,PCR反应体系(20 μL): 2 μL 10×LA PCR Buffer(Mg2+ Plus), 0.1 μL pyrobest DNA聚合酶, 1.6 μL dNTP (dATP,dTTP,dCTP,dGTP 2.5 mmol·L-1 each), 2 μL SUTF (5 mmol·L-1), 2 μL SUTR (5 mmol·L-1), 1 μL(≈10 ng cDNA)模板和11.3 μL超纯水。反应条件为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 1 min,55~65 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,35个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳,回收目的条带后经过加A反应,按照Promega公司的pGEM-T easy载体快速连接试剂盒操作流程,将回收的DNA片段直接连到载体上,转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α菌株,经蓝白斑筛选,提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后,送北京三博远志科技有限公司测序。

1.3 二级结构预测与序列分析

应用DANSTAR, SMART, HMM-TM, Blast, MOTIFSCAN和MEGA4等软件对序列进行分析。

1.4 组织特异性表达检测

提取绿竹叶片、叶鞘、幼茎和根的RNA,反转录成cDNA第1链,利用RT-PCR法确定BoSUT2基因在不同器官中的表达量。PCR反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,28个循环; 72 ℃延伸10 min。

1.5 表达载体的构建

根据pBI121的多克隆位点,设计直接添加酶切位点的引物。上游引物1的5′端添加XbaⅠ酶切位点,SUTF1: 5′-AATCTAGAATGGAGGAAGGCCGGAGCGAT -3′; 下游引物2的5′端添加BamHⅠ酶切位点,SUTR1: 5′-GGATCCGTGCCCGCTGGCCACAACAG-3′。以前面测序正确的质粒为模板进行PCR扩增。扩增产物连接到T-easy载体上,经测序正确后采用双酶切(XbaI和BamHⅠ双酶切)直接构建到载体pPZP-GFP的多克隆位点,形成包含BoSUT2基因与GFP融合的植物表达载体。

1.6 烟草悬浮细胞转化与亚细胞定位观察

转化烟草悬浮细胞BY-2(Chen et al., 2007):将BoSUT2基因与GFP融合的植物表达载体转入农杆菌,经菌落PCR鉴定后,选取单克隆培养,过夜,用LB液体培养基洗涤2次后再用1/2 LS悬浮待用使OD≈0.6;取10 mL培养3~5天的BY-2细胞加入1 mL农杆菌摇匀后静置4 h,使农杆菌侵染BY-2;加入10 mL新鲜的NT液体培养基暗培养,28 ℃ 120 r·min-1水平摇动; 28~36 h后吸去上清,用枪头挑取少量细胞用1 mL NT液体培养基平铺到含抗生素的LS选择平板(含卡那霉素50 μg·mL-1、羧苄青霉素200 μg·mL-1以及头孢霉素200 μg·mL-1)上,28 ℃暗培养; 待平板上的细胞长大聚集成团后转移至液体LS中28 ℃ 120 r·min-1振荡培养。同时以仅转化pPZP-GFP的烟草悬浮细胞做对照。利用激光共聚焦扫描显微镜对目的基因在烟草悬浮细胞内的定位进行观察,采集图像。

2 结果与分析 2.1 BoSUT2基因的克隆

应用同源基因克隆技术,获得了1 700 bp左右目的片段,测序结果表明,目的片段为1 668 bp,包含1个完整的读码框,编码555个氨基酸(图 1),其理论等电点和分子质量分别为8.752和59 832.15 u,命名为BoSUT2(sucrose transporter 2 from Bambusa oldhamii),GeneBank注册号为: EU247931。

图 1 BoSUT2编码区核酸序列及其推导出的氨基酸序列(阴影部分为跨膜区) Figure 1 Nucleotide and predicted amino acid sequence of BoSUT2 (transmembrane regions in shadow)
2.2 BoSUT2蛋白同源性比较与系统进化树分析

应用在线软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)比较结果显示,BoSUT2与单子叶植物的蔗糖转运蛋白的氨基酸序列都有较高的一致性,如与水稻、玉米、甘蔗(Saccharum hybrid cultivar)、小麦、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)的SUT编码的氨基酸序列的一致性分别达到74.0%, 71.9%, 53.6%, 52.0%, 51.0%和51.1%。与双子叶植物的蔗糖转运蛋白基因的一致性要稍低一些,如与拟南芥的SUT2的一致性仅为45.1%。与绿竹中已分离的BoSUT1的一致性为92.3%,这说明分离的BoSUT2基因是绿竹蔗糖转运蛋白基因家族的1个新成员。应用MEGA4软件进行系统进化树分析,结果显示绿竹与水稻、玉米等单子叶植物位于较近的分支点上,而双子叶植物拟南芥等则在另一个分支上(图 2), 这与形态学分类相吻合。

图 2 基于SUT基因编码蛋白的系统进化树分析 Figure 2 Phylogenetic tree analysis of proteins encoded by SUT genes 每个分支上的数字表示1 000次重复搜索的靴带值。 Numbers on major branches indicate bootstrap estimates for 1 000 replicate analyses.
2.3 BoSUT2氨基酸序列分析与结构预测

通过DNAStar软件对BoSUT2氨基酸序列进行分析预测,在555个氨基酸中以疏水性氨基酸为主,共237个,占总数的42.7%;其次是极性氨基酸, 有125个, 占总数的22.5%;碱性氨基酸、酸性氨基酸分别有49个和38个,各占总数的8.8%和6.8%。经过SMART和MOTIFSCAN软件分析,BoSUT2氨基酸序列包含1个保守的结构域(45-552)糖运转子,第171-174位为N-糖基化位点; 还包括蛋白激酶C的磷酸化位点9个(33-35, 101-103, 105-107, 222-224, 255-257, 317-319, 402-404, 428-430, 446-448)、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点3个(12-15, 29-32, 441-444)、N-肉豆蔻酰化位点16个(23-28, 30-35, 53-58, 73-78, 218-223, 236-241, 270-275, 305-310, 372-377, 379-384, 442-447, 459-464, 481-486, 516-521, 522-527, 544-549)、氨基化位点3个(33-36, 108-111, 135-138)、cAMP-和cGMP-dependent磷酸化位点1个(399-402),符合蔗糖运转子特征(Lemoine et al., 1989)。

应用在线软件对BoSUT2氨基酸序列进行拓扑学分析,结果显示BoSUT2的二级结构中具有明显的α-螺旋结构和β-折叠结构。HMM-TM软件分析预测,BoSUT2包含10个跨膜结构域(图 3),跨膜部分序列分别为41-49、80-98、114-132、272-290、323-340、376-394、407-427、448-466、483-503和520-538(图 1),属于膜蛋白。

图 3 BoSUT2编码的蛋白跨膜结构域预测 Figure 3 Transmembrane domains prediction of the protein encoded by BoSUT2
2.4 BoSUT2基因在不同部位的表达

以绿竹Actin基因作内标(李雪平等,2007),调整cDNA用量和循环数,使内标基因的表达丰度一致。以调整后的cDNA模板量进行BoSUT2基因的扩增。结果(图 4)表明,BoSUT2基因在叶片、叶鞘和根中均有表达,其中在叶片和叶鞘中的表达丰度较高且比较接近,在根中有微弱表达,而幼茎中没有检测到表达。

图 4 BoSUT2基因的RT-PCR分析 Figure 4 RT-PCR analysis of BoSUT2 gene 1:叶片Leaf; 2:叶鞘Sheath; 3:幼茎Stem; 4:根Root.
2.5 BoSUT2:GFP融合蛋白表达载体的构建

SUTF1和SUTR1的PCR产物测序结果表明:插入片段为1 682 bp, 包含了BoSUT2基因编码区(1 668 bp)添加的酶切位点XbaⅠ(TCTAGA)、BamHⅠ(GGATCC)以及2个保护碱基AA。序列分析表明在BoSUT2基因内部有1个XhoⅠ位点(第4位),选用XbaⅠ/ BamHⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ对构建的载体质粒进行酶切指纹分析(图略)。结果显示与预期的完全一致,证明所构建的载体是正确的, 即获得了由35S启动,包含BoSUT2:GFP融合的植物表达载体(图 5)。

图 5 BoSUT2:GFP融合植物表达载体 Figure 5 Confusion expression vector of BoSUT2:GFP
2.6 亚细胞定位观察

取烟草抗性悬浮细胞进行显微镜观察,结果表明,在488 nm激发光下观察,绿色荧光信号主要分布在细胞膜上(图 6 A, B), 而只转化GFP的对照BY-2细胞中,绿色荧光信号分布在整个细胞,没有特异性(图 6 C, D)。由此证明BoSUT2:GFP融合蛋白位于烟草悬浮细胞中的细胞膜上,进一步证实BoSUT2基因编码膜蛋白。

图 6 BoSUT2:GFP在烟草中亚细胞定位 Figure 6 Subcellular localization of BoSUT2:GFP in tobacco BY-2 cells A, B: BoSUT2:GFP在BY-2细胞膜上表达BoSUT2:GFP localization on membrane of BY-2 cells; C, D:对照GFP在BY-2细胞中表达GFP expressing in BY-2 cells alone.
3 讨论

蔗糖转运蛋白是跨膜蛋白,疏水氨基酸含量很高,有高疏水性(Lalonde et al., 1999),而疏水氨基酸含量高有利于跨膜结构域的形成。BoSUT2编码蛋白的疏水氨基酸含量占42.7%,这十分有利于跨膜结构域的形成,实现其运输功能,这与BoSUT2的拓扑结构相符合。已发表的植物蔗糖转运蛋白都含有l2个跨膜结构域,而在BoSUT2的预测中仅含有10个,由图 2可知,在150-250还有2个跨膜结构,但不明显,这可能与竹子物种自身“非草非木”的特点密切相关,是否为跨膜结构尚需进一步证明。综合BoSUT2的结构特点以及系统进化树分析(胥婷等, 2006),BoSUT2应属于SUT2亚群。BoSUT2BoSUT1在核酸水平(cDNA)一致性为94.3%,在蛋白水平为92.3%,说明它们是同一家族的不同成员。

本研究BoSUT2:GFP融合蛋白在烟草悬浮细胞中表达的结果表明,BoSUT2定位于细胞膜上,这与前人研究结果植物蔗糖转运载体蛋白分布于植物细胞质膜上相一致(Lemoine, 2000)。蔗糖作为一种信号分子, 参与控制植物体内同化产物的转运效率与分配方式(Smeekens, 2000),但是BoSUT2蛋白是如何与蔗糖分子相互作用,其在竹子体内对蔗糖是如何运转的需要通过试验来验证。

在蔗糖转运蛋白基因家族中,不同的蔗糖转运蛋白基因执行的具体功能不同,其表达的部位也可能不同,在不同植物中也有差异。例如, 水稻OsSUT1基因和玉米的ZmSUT1基因在种子中表达量高, 而小麦的TaSUT1A在不同的组织部位都有表达(Aoki et al., 1999; 2002; Gottwald et al., 2000)。本研究中获得的绿竹BoSUT2在叶片和叶鞘中的表达量较高, 在幼茎中没有检测到表达,说明该基因的表达具有很明显的组织特异性, 而且可能对光合作用产物——糖的卸载有着重要作用。已有研究表明,介导蔗糖转运的转运蛋白具有重要作用,这已经在马铃薯和烟草转反义基因植株中得到证实,蔗糖转运蛋白基因表达受阻遏后,蔗糖转运也强烈地受抑制,反义植株发育迟缓,生产下降,这表明转运蛋白对蔗糖转运是必不可少的(Riesmeier et al., 1994)。用拟南芥的AtSUC2基因的敲除突变体研究蔗糖转运蛋白的作用结果表明,突变体植株中蔗糖转运严重受阻碍,源叶片中积累大量淀粉,植株生长矮小、发育迟缓而且不结实,或者结实但产生的种子不可育(Gottwald et al., 2000)。因此,从绿竹中分离蔗糖运转子基因,构建BoSUT2基因植物表达载体对基因的功能进行鉴定研究,将有助于从分子水平上研究蔗糖转运蛋白对竹子生长发育的调控机制。

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