林业科学  2010, Vol. 46 Issue (2): 32-38   PDF    
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文章信息

安新民, 王冬梅, 王泽亮, 王静澄, 曹冠琳, 薄文浩, 张志毅
An Xinmin, Wang Dongmei, Wang Zeliang, Wang Jingchen, Cao Guanlin, Bo Wenhao, Zhang Zhiyi
毛白杨PtLFY在花芽发育中的表达模式与花芽形态分化
Expression Profile of PtLFY in Floral Bud Development Associated with Floral Bud Morphological Differentiation in Populus tomentosa
林业科学, 2010, 46(2): 32-38.
Scientia Silvae Sinicae, 2010, 46(2): 32-38.

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收稿日期:2009-09-18

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安新民
王冬梅
王泽亮
王静澄
曹冠琳
薄文浩
张志毅

毛白杨PtLFY在花芽发育中的表达模式与花芽形态分化
安新民, 王冬梅, 王泽亮, 王静澄, 曹冠琳, 薄文浩, 张志毅    
北京林业大学 林木育种国家工程实验室 林木花卉遗传育种教育部重点实验室 北京 100083
摘要: 以毛白杨花芽为材料, 采用RT-PCR技术分离克隆毛白杨PtLFY cDNA序列, 测序结果表明该序列全长1 314 bp, 包含1个开放阅读框,编码377个氨基酸。Alignment分析显示该基因与拟南芥等物种LFY/FLO同源基因所编码的氨基酸相似性达到68%~75%。蛋白结构预测分析表明,在PtLFY蛋白N-端和C-端具有2个高度保守的区域,其中PtLFY-C端由7个α-helix组成Helix-turn-helix结构。采用Real-time qRT-PCR技术检测PtLFY在雌雄花芽发育过程中的表达模式,结果显示从9月13日到翌年1月25日, PtLFY在毛白杨雌雄花芽中持续稳定表达, 到2月25日表达量少许下调,但该基因在雄花芽中的相对表达量明显高于雌花芽。解剖分析结果表明,雄花芽形态分化进程明显早于雌花芽,这种差异可能与PtLFY在雌雄花芽发育过程的差异表达存在密切联系。研究结果对于阐明PtLFY在毛白杨雌雄花芽发育和开花中的分子作用机制具有重要的理论意义,为进一步开展毛白杨开花调控研究奠定基础。
关键词:毛白杨    PtLFY    表达模式    花芽    形态分化    qRT-PCR    
Expression Profile of PtLFY in Floral Bud Development Associated with Floral Bud Morphological Differentiation in Populus tomentosa
An Xinmin, Wang Dongmei, Wang Zeliang, Wang Jingchen, Cao Guanlin, Bo Wenhao, Zhang Zhiyi    
National Engineering Laboratory for Tree Breeding Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education Beijing Forestry University Beijing 100083
Abstract: A full-length cDNA denominated PtLFY was obtained from Populus tomentosa using RT-PCR technique. PtLFY is 1 314 bp and contains an open reading frame encoding a 377 amino acid polypeptide. Sequence analysis by blast showed that PtLFY shares 68%-75% homology in amino acid sequence with that encoded by Arobidopsis LFY and other species LFY/FLO homologues. It was found that PtLFY protein contains 2 conserved domains at N-terminal and C-terminal by alignment analysis. PtLFY-C region consists of a seven-α helix fold structure that binds target promoter DNA elements. The expression patterns of PtLFY in developmental floral buds were examined using real-time quantitative RT-PCR. The result showed that the continuous and stable transcripts of PtLFY were detected in both male and female floral buds of P.tomentosa from September 13th to January 25th, and then a slight decline was detected on February 25th. The relative expression of PtLFY in male floral buds was obviously much higher than that in female floral buds. The anatomical results showed that initiation and differentiation of male floral buds were obviously earlier than female floral buds. It revealed that there is close relationship between expression of PtLFY and morphological differentiation of floral buds in P.tomentosa. This study shed light on the molecular mechanism of PtLFY in development of both male and female floral buds and flowering in P.tomentosa, and the knowledge will benefit regulation of flowering.
Key words: Populus tomentosa    PtLFY    expression profiling    floral buds    morphological differentiation    qRT-PCR    

毛白杨(Populus tomentosa)是我国特有的白杨派树种,雌雄异株,但偶见雌雄同株现象(张志毅等, 1992)。在开花发育方面,董源(1982; 1984)就进行了毛白杨的胚胎学观察研究; 朱大保(1990)对毛白杨的有性生殖能力进行了研究; 张志毅等(1992; 2000)先后对毛白杨开花结实特性和三倍体毛白杨的有性生殖能力进行了研究。杨树作为木本模式树种,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)有许多不同之处,杨树具有多年生、童期长达7~10年、生命周期长达100~200年等特点(Braatne et al., 1996)。另外杨树在生命中首次经历开花事件后,一年一次的季节性开花现象伴随杨树的整个生殖阶段(Yuceer et al., 2003)。这些特点决定了杨树具有自身的花发育规律。杨树的花结构也不同于拟南芥等模式植物具有的四轮花器官结构,仅由苞片和雄蕊或雌蕊两轮结构组成(Sheppard et al., 2000), 这种结构差异的分子机制尚不清楚。早在20世纪90年代初,有关花分生组织特征基因和花器官特征基因在拟南芥、金鱼草(Antirrhinum majus)等许多植物中相继被分离(Schultz et al., 1991; Coen et al., 1990)。这些基因的发现,使得人们对植物的成花和花器官的发生与发育机理的认识进入到分子水平。作为花分生组织特征基因,LEAFY (LFY)控制拟南芥花序梢分生组织向花分生组织的转变(Weigel et al., 1992; 1995; Peňa et al., 2001)。LFY的表达水平被认为是开花转变的关键因子(Nilsson et al., 1998)。尽管Rottmann等(2000)从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离克隆了PTLF基因,并在杨树和拟南芥中进行了转化研究,但杨树LFY同源基因在花芽发育过程的表达模式尚不清楚,关于该基因的表达与杨树花芽分化关系的研究还未见报道。为此开展毛白杨LFY同源基因cDNA的克隆及其表达规律的研究,并对毛白杨雌雄花芽的形态分化规律进行解析,分析毛白杨LFY同源基因的表达与花芽分化的内在关系,对于揭示毛白杨开花的分子调控机制具有重要的理论意义,为进一步通过基因工程手段实现缩短育种周期和抑制杨树花粉与飞絮污染的研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

供试毛白杨雌雄成年植株定植于北京林业大学苗圃,分别采集不同发育阶段的雌雄花芽,一部分固定在FAA固定液中于4 ℃保存,用于花芽形态解剖观察分析,另一部分液氮速冻贮于-70 ℃冰箱中,用于RNA提取。

1.2 方法 1.2.1 PtLFY cDNA的克隆和测序

雌雄花芽总RNA的提取采用改良的CTAB法(Chang et al., 1993), 逆转录与cDNA第1链的合成按照SMART IV cDNA Library Construction Kit (BD Clontech)说明书进行。50 μL PCR反应体系包括1 μL cDNA第1链,各0.2 μmol·L-1上游引物P1U和下游引物P1D(表 1),1×PCR反应缓冲液,2 mmol·L-1 MgCl2,200 μmol·L-1 dNTPs和2单位Taq DNA聚合酶。PCR循环条件为94 ℃预变性3 min,最后72 ℃延伸7 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共进行35轮循环。DNA序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司测定。DNA序列分析采用Seq Aid Ⅱ和Bioedit软件包进行。

表 1 用于毛白杨PtLFY基因克隆和RT-PCR分析的引物 Tab.1 PCR primers used in cloning of PtLFY and RT-PCR analysis
1.2.2 序列同源性分析与蛋白结构预测

LFY同源基因氨基酸序列来自GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi),Alignment分析采用CLUSTALX1.81进行,PtLFY蛋白二级结构预测采用ANTHEPROT 2000 V6.0软件进行, 保守序列和功能域分析采用ExPASy软件(http://cn.expasy.org/) (Gasteiger et al., 2003), PtLFY蛋白三级结构预测分析采用3D-JIGSAW 2.0 (http://bmm.cancerresearchuk.org/~3djigsaw/), 进一步采用RasMol V 2.7.2.1进行优化。

1.2.3 Real-time qRT-PCR分析

按照Chang等(1993)的方法,分别提取毛白杨不同发育时期雌雄花芽的总RNA, 用RQ1 DNase I (Promega)对总RNA进行处理以去除DNA污染。RNA浓度的测定采用SPEKOL 1300 spectrophotometer (Jena)。根据SuperScriptTM Ⅲ Platinum® Two-Step qRT-PCR Kit With SYBR® Green (Invitrogen)说明,分别取预处理后不同样品总RNA 1 μg,进行cDNA第1链合成,然后将第1链cDNA稀释5倍作为PCR的反应模板,进行qPCR反应。20 μL qPCR反应体系包括1 μL稀释5倍的cDNA第1链,各0.2 μmol·L-1上游引物P2U和下游引物P2D (表 1),10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen), 反应在OPTICON2 (MJ research)中进行。qRT-PCR热循环条件为50 ℃, 94 ℃各2 min, 最后72 ℃延伸7 min,94 ℃变性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共进行35轮循环。以18S rRNA作为内参基因,采用上游引物P3U和下游引物P3D (表 1)进行PCR反应,反应体系和热循环条件同上。以上试验均为3次重复。

1.2.4 花芽解剖结构分析

定期采集毛白杨雌雄花芽样品,按照李正理(1996)林加涵(2000)的方法,对样品进行如下处理:固定—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—贴片—脱蜡—复水—番红、固绿染色—封藏,切片厚度为10 μm, 用加拿大树胶封片。在OlympusAx70光学显微镜下观察、拍照记录。

2 结果与分析 2.1 毛白杨PtLFY基因的分离克隆

为了从毛白杨中分离PtLFY同源基因,首先根据美洲黑杨(Populus deltoides)LFY同源基因(PTLF)设计合成了1对PCR引物(P1U, P1D),利用RT-PCR技术从毛白杨雄花芽mRNA中分离PtLFY。PCR结果如图 1所示,扩增出长度大约为1.3 kb条带。将该片段克隆并测序。结果表明该基因序列长度为1 314 bp,包含1个完整的阅读框(ORF), 编码377氨基酸(图 2)。

图 1 PtLFY cDNA的PCR扩增 Figure 1 Cloning of PtLFY cDNA M. DL-2000 marker; 1.PCR产物PCR product.
图 2 毛白杨PtLFY cDNA及推测的氨基酸序列 Figure 2 The cDNA and deduced amino acid sequence of PtLFY from Populus tomentosa
2.2 序列同源性分析与蛋白结构预测

在GenBank进行Blast检索,结果表明毛白杨PtLFY编码的氨基酸与毛果杨PTLF (U93196)、金鱼草FLO (M55525)、烟草(Nicotiana tabacum)NFL1 (U15798)和NLF2 (U15799)、苹果(Malus domestica)ALF1 (AB056158)和ALF2 (AB056159)、矮牵牛(Petunia hybrida)ALF (AF030171)、巨桉(Eucalyptus grandis)ELF1 (AF034806)所编码的氨基酸同源性分别为99%, 75%, 70%和70%, 68%和69%, 68%, 68%。通过与其他物种的同源基因比较发现,在这些同源基因的N-端与C-端各具有1个高度同源保守区,分别在氨基酸37-162和203-360之间,这是LFY及其同源基因的一个显著特征。

为分析预测PtLFY蛋白的分子功能,联合使用ANTHEPROT 2000 V6.0, Protein Analysis System (ExPASy) (SIB) (http://cn.expasy.org/) (Gasteiger et al., 2003)和3D-JIGSAW 2.0对PtLFY可能的二级、三级结构进行了模拟构建。结果表明PtLFY-C端保守区由2个β-sheet和7个α-helix结构组成(图 3),其空间结构如图 4C所示,与HTH (Helix-Turn-Helix)结构极其相似,其中α2-helix (图 4A)、α3-helix (图 4B)在PtLFY蛋白与目标DNA结合的特异序列识别中非常重要,参与了PtLFY与DNA大沟和小沟的识别。拟南芥LFY蛋白α2-helix中Asn (N)291和α3-helix中Lys (K) 307参与了DNA大沟的碱基特异识别,Arg (R)237介导了DNA小沟的识别(Hamès et al., 2008)。PtLFY-C蛋白中相应结构α2-helix中Asn (N)258与α3-helix中Lys (K)277以及Arg (R) 206,可能发挥类似的功能。

图 3 PtLFY-C端保守区二级结构元件和相应的氨基酸序列 Figure 3 Secondary structure elements of the conserved PtLFY-C terminal and correspondent amino acid sequence 二级结构元件用箭头和矩形框表示。 Secondary structure elements are indicated using arrow and rectangle frame.
图 4 PtLFY-C端的结构 Figure 4 Structure of the PtLFY-C terminal region A. α2螺旋空间结构Spatial structure of the α2 helix; B. α3螺旋空间结构Spatial structure of the α3 helix; C. PtLFY-C端的三级结构Tertiary structure of PtLFY-C terminal region.
2.3 PtLFY在花芽发育过程中的表达模式

为了探明PtLFY在毛白杨雌雄花芽发育过程中的表达规律,分别收集了9月13日、11月24日、12月10日、12月24日、1月25日及2月25日6个不同发育时期的花芽,分别提取其总RNA,进一步定量均一化,以18S rRNA为内参基因,进行Real-time qRT-PCR分析(图 5)。自当年9月13日至翌年1月25日,PtLFY在雄花芽中持续稳定高丰度表达,到2月25日时,该基因的表达量有轻微下调(图 5A); 而在同期的雌花芽中,PtLFY表达与在雄花芽中具有相似的趋势,但其相对表达量远低于在雄花芽中的表达量(图 5B)。

图 5 PtLFY基因在毛白杨雌雄花芽发育过程中的表达模式 Figure 5 The expression pattern of PtLFY gene during both male and female floral buds development in P. tomentosa trees A.雄花芽发育过程中PtLFY基因的实时qRT-PCR分析Real-time qRT-PCR analysis of PtLFY during male floral buds development; B.雌花芽发育过程中PtLFY基因的实时qRT-PCR分析Real-time qRT-PCR analysis of PtLFY during female floral buds development.
2.4 花芽解剖结构分析

为了解毛白杨花芽形态分化的基本规律,分别对不同发育时期的雌雄花芽进行显微观察分析,雌花芽的形态分化如图 6所示。在北京地区,毛白杨雌花芽形态分化始于7月底8月初,此时花序原基开始形成(图 6A); 此后发育进程加快,小花原基分化,到8月29日,子房雏形初步形成,侧膜胎座出现,花序基本成形(图 6B); 9月28日,部分子房从外形看已经发育完整(图 6C)。之后经过3个多月的发育,子房内部结构不断完善(图 6D, E),到翌年1月25日,含有2个心皮的单室子房和柱头形成,柱头二分裂,花柱中空,基生胎座,胚珠倒生于胎座上,珠柄发达,单珠被,通常珠心较厚(图 6F)。

图 6 毛白杨雌花芽不同发育阶段的解剖分析 Figure 6 Anatomic analysis of female floral buds during different stages in P. tomentosa A.花芽纵切:花原基出现(8月4日,×100) Longitudinal section of floral bud: the primordia arise from apices of bud (Aug. 4, ×100); B.花芽纵切:子房雏形(8月29日,×100) Longitudinal section of an inflorescence: early ovary (Aug. 29, ×100); C.花芽纵切:子房形成(9月28日,×100) Longitudinal section of a part of an inflorescence: formation of ovary (Sept. 28, ×100); D.子房纵切(11月24日,×100) Longitudinal section of an ovary (Nov. 24, ×100); E.子房纵切(12月24日,×100) Longitudinal section of an ovary (Dec. 24,×100); F.子房纵切:可见二分叉的柱头和倒生的胚珠(1月25日,×100) Longitudinal section of several ovaries: developing anatropous ovule and clear carpel with two splits(Jan. 25, ×100).

毛白杨雄花芽的形态分化如图 7所示。雄花器官的发育并不集中在花芽的顶端,在环状的花原基边缘不断膨大的突起的组织环,中间的细胞分化慢,其结果是一个凹陷的分生组织区,花的发端出现(图 7A)。经过大约1个半月的发育,圆盘状的分生组织伸出,雄蕊原基出现,雄花序形成(图 7B)。之后经过约半月的发育,每个花盘内花药形状已经非常明显(图 7C),花药进一步发育(图 7D), 到10月中旬,花粉囊成形,可见4个花粉囊室。到12月中旬,花粉囊完全成形,横切面呈蝴蝶形,4个花粉囊室清晰可见,花粉渐趋成熟(图 7F)。

图 7 毛白杨雄花芽不同发育阶段的解剖分析 Figure 7 Anatomic analysis of male floral buds during different stages in P. tomentosa A.花芽纵切:花的发端(6月4日,×100) Longitudinal section: floral apices(June 4, ×100); B.花序纵切(7月20日,×100) Longitudinal section of whole inflorescence(July 20, ×100); C.花序局部纵切:雄蕊原基(8月4日,×100) Longitudinal section of a part of an inflorescence: initiation of stamen primordial (Aug.4, ×100); D.局部花序纵切:发育的花药(9月13日,×100) Longitudinal section of a part of an inflorescence: developing anther(Sept.13, ×100); E.花粉囊横切(10月17日,×100) Transverse section of an anther (Oct.17, ×100); F.花粉囊横切:花粉囊成形,花粉渐成熟(12月24日,×100) Transverse section of an anther: morphological completion and mature pollen(Dec. 24, ×100).
3 讨论

本研究从毛白杨花芽mRNA中分离克隆了PtLFY, 并与之前分离的基因组DNA序列进行了比较,证实该基因确由3个外显子和2个内含子组成,编码377个氨基酸(An et al., 2005),它与拟南芥LFY、桉树ELF1、矮牵牛ALF、苹果ALF1ALF 2、烟草NFL1NLF 2、金鱼草FLO及毛果杨PTLF具有58%~99%的相似性。通过比较发现不同物种LFY同源基因的N-端和C-端各有1个非常保守的区域。LFY基因C-端保守区的晶体结构已经得到解析,由7个α-helix构成,其中α2和α3螺旋在与靶标DNA结合识别过程中至关重要,从分子结构水平说明了转录因子LFY在开花调控中的作用机制(Hamès et al., 2008)。经过系列生物信息学软件预测分析表明,PtLFY基因C-端氨基酸具有类似的Helix-turn-helix结构(图 3图 4),这种序列上的高度同源性和结构上的高度相似性说明PtLFY在杨树开花发育中具有相似的功能。与一些具有双拷贝LFY同源基因的苹果、桉树、银杏(Ginkgo biloba)、烟草等双子叶植物不同,毛白杨基因组DNA中只有单拷贝的PtLFY基因(An et al., 2005)。由此可见,PtLFY在控制毛白杨开花转变过程中的作用无可替代。

Rottmann等(2000)研究表明,PTLF不仅在发育的花序中强烈表达,而且在叶原基、幼叶(在靠近花序的顶端营养芽中最明显)、幼小实生苗中也有表达。在其他木本植物中,LFY同源基因的表达也不总是在生殖发育过程中表达,在桉树和葡萄(Vitis vinifera)的叶原基中也有表达(Southerton et al., 1998; Dornelas et al., 2004; Carmona et al., 2002)。在猕猴桃(Actinidia deliciosa)、葡萄和苹果中观察到了LFY同源基因季节性的表达现象(Walton et al., 2001; Carmona et al., 2002; Wada et al., 2002)。此外,通过PTLF启动子驱动GUS基因的研究发现,GUS在杨树的枝条中观察到强烈的表达(Wei et al., 2006)。本次着重研究了PtLFY在毛白杨雌雄花芽发育过程的表达模式,从9月13日至翌年2月25日,无论雌雄花芽均检测到PtLFY基因持续稳定的转录本,而且在雄花芽中PtLFY基因的相对表达量远远高出同期雌花芽(图 5)。该结果为阐明PtLFY在花发育分子机制中的作用提供了新的证据。

研究发现毛白杨雌雄花芽形态分化进程差异较大,雄花芽的形态分化明显早于雌花芽。雄花的原基的出现始于6月初(图 7A),雌花原基的出现则晚2个月(图 6A); 雄花序雏形形成于7月中旬(图 7B),而雌花序形成则在8月底(图 6B)。之后雌雄花蕊进入快速发育时期,到12月24日时雄蕊发育基本完善,花粉囊横切面呈蝴蝶形,雄蕊发育花粉逐渐成熟(图 7F)。1个月后,子房发育较为完善,可见二分叉的柱头和倒生的胚珠(图 6F)。一方面,实时qRT-PCR分析结果为上述雌雄花芽发育进程的差异提供了分子证据,PtLFY在毛白杨雌雄花芽发育过程中的表达模式与雌雄花芽形态分化进程相耦合,PtLFY基因持续稳定高水平的表达促进杨树雌雄花芽的形态分化,说明了PtLFY基因在杨树花发育中的重要作用。毛白杨雌雄花芽形态分化进程的差异解释了雄花开花早于雌花的原因。另一方面,毛白杨雌雄花芽形态分化进程的差异为解释自然界雄花开放早于雌花现象提供了证据。

本研究不仅对于阐明PtLFY在毛白杨雌雄花发育中的分子机制具有重要的理论意义,而且对于进一步开展毛白杨开花调控、缩短育种周期、控制花粉飞絮污染等方面具有潜在的应用价值。

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