植原体(phytoplasma)，原称类菌原体(MLO)，在植物和昆虫中广泛分布，为无细胞壁原核微生物，尚不能在人工培养基上离体培养。迄今，世界各地已统计有1 000多种植物自然感染植原体病害(Seemüller et al., 1998)，我国也报道了100多种植物植原体病害(赖帆等，2008)。20世纪90年代以来，PCR及分子克隆等分子技术被应用于植原体的研究以后，植原体检测、鉴定和鉴别技术有了很大的发展，逐步确立了以核酸信息为主要依据的植原体分类鉴定方法。根据16S rDNA的PCR产物的RFLP分析结果，植原体属被分成14个组和1个未确定组，38个亚组，候选种有5个，即16SrII的Ca. Phytoplasma aurantifolia和Ca. Phytoplasma australasia，16SrVII的Ca. Phytoplasma fraxini，以及16SrXII的Ca. Phytoplasma ausraliense和Ca. Phytoplasma japonicum(Lee et al., 2000)。随着分子生物学技术特别是测序技术的发展，植原体序列信息迅速增多，为满足植原体分类鉴定要求，国际菌原体研究计划植原体分类小组制定了植原体分类和候选种鉴定的规则，分7条进行了描述，其中1条为“如果某一植原体株系的16S rRNA基因序列与已经命名的植原体候选种的同源性小于97.5%，则可以描述成1个新的候选种”。此规则的发表为今后植原体候选种的鉴定研究工作提供了理论依据，在此论文中，植原体被分成了15个组，26个候选种(The IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team-Phytoplasma taxonomy group，2004)^, ，目前已发表的候选种已有30个(Saskia et al., 2008)。随后，虚拟RFLP也被应用于植原体的分类鉴定，并将植原体属分成了28个组(Wei et al., 2007)。另外植原体的rp核糖体蛋白基因的分类研究结果证明: rp基因比16S rRNA保守性差，可用于植原体属近缘株系的区分和鉴定(Martini et al., 2007)。

猪屎豆(Crotalaria pallida)，属豆科(Leguminosea)猪屎豆属，多年生小灌木。原产于中国福建、广东、云南、台湾以及印度、非洲、马来西亚等地。分布于低海拔山野、路旁、荒地、干燥河床等向阳处所，耐旱耐贫瘠，是农田和道路两旁边坡常见的植物，也极适合栽种于田里当绿肥植物，茎叶可做绿肥和饲料。戴月明等(1981)在我国广东省博罗县猪屎豆上发现丛枝病害的发生，并通过电镜证明在病叶叶脉筛管内存在大小为90~100 nm的植原体细胞。李永等(2006)应用16S rDNA的序列同源性，初步确定猪屎豆丛枝病植原体为植原体属，花生丛枝组成员。本试验通过对猪屎豆丛枝病植原体16S rDNA的序列分析、计算机虚拟RFLP分析以及rp基因序列分析，对猪屎豆丛枝病植原体进行了系统的鉴定研究。构建的基于16S rDNA的序列和rp基因序列系统发育树, 探究猪屎豆丛枝病植原体与花生丛枝病植原体亲缘关系。

1 材料与方法 1.1 植原体样品

2004年从海南省三亚市鹿回头公园采集猪屎豆丛枝样品, 枝叶表现典型丛枝症状的(图 1)；本试验设阳性和阴性对照各1个，阴性对照为健康猪屎豆枝叶样品，采自海南省三亚市鹿回头公园(图 2)；阳性对照来自本实验室多年保存的泡桐丛枝病组织培养苗。

1.2 DNA提取与PCR扩增

DNA提取:称取猪屎豆丛枝样品、阳性对照和阴性对照的叶片各0.3 g，放入灭菌研钵，然后向研钵中倒入液氮冷冻叶片并将其研碎，采用常规的CTAB法提取植物总DNA，于-20 ℃保存备用。PCR反应:应用2对植原体的特异性引物分别以提取的3个植物总DNA为模板进行PCR扩增，16S rDNA的引物对为P1/P7(引物序列和PCR反应条件详见Deng et al., 1991)，rp引物对rpF1C/rp(Ⅰ)R1(引物序列和PCR反应条件见Martini et al., 2007)。健康猪屎豆总DNA为阴性对照模板和泡桐丛枝病组培苗总DNA为阳性对照的模板。电泳检测: PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，80 V电泳1 h，SYBR Green Ⅰ染色，用Sygene凝胶成像系统观察并记录电泳结果。

1.3 16S rDNA和rp基因PCR产物的序列分析

将植原体16S rDNA和rp基因的PCR产物经DNA纯化试剂盒(北京鼎国生物技术发展中心)纯化后，连接到PMD18-T载体上，用热击发法转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中(DH5α)，涂板培养37 ℃倒置培养16~20 h(选用抗生素为氨苄青霉素)，挑取白色菌斑于LB液体培养中37 ℃摇床上震荡培养并提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.4 16S rDNA序列的虚拟RFLP分析

将猪屎豆丛枝病植原体16S rDNA序列和从NCBI核酸数据库中调出的16SrⅡ组中5个亚组中具代表性的植原体16S rDNA序列(酶切序列名称、序列号、亚组信息见表 1)输入DNAstar 5.01软件，应用Genequest程序对6种植原体的16S rDNA序列进行限制性酶切位点分析，从十几个限制性内切酶中筛选出了3个(MaeⅢ，MseⅠ，TaqⅠ)，并应用agarose Gel Simulation程序输出酶切电泳图片，根据酶切片段的大小和数量的异同来确定猪屎豆丛枝病植原体亚组的分类地位。

1.5 序列同源性比较、系统发育树构建

分别从NCBI核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi)中调出15个植原体组中具有代表性的22个的16S rDNA序列和12个rp基因序列，以及Acholeplasma laidlawii的16S rDNA序列和rp基因序列。应用DNAstar5.01分析软件分别对所选植原体23个16S rDNA序列和13个rp基因序列进行多序列同源性比对分析。应用分子进化遗传分析软件MEGA3.1分别构建基于16S rDNA序列、rp基因序列的分子系统发育树。首先应用CLUSTALW程序分别对所选16S rDNA序列、rp基因序列进行对位排列，然后用邻接法(NJ)构建bootsrap分子系统有根树，组外对照为Acholeplasma laidlawii。

2 结果与分析 2.1 PCR扩增结果

电泳结果显示: P1/P7引物对成功的从染病猪屎豆和阳性对照总DNA中均扩增出特异性DNA片段，片段大小为1 806 bp；rpF1C/rp(Ⅰ)R1引物对从染病猪屎豆和阳性对照总DNA中均扩增出1 294 bp的特异性DNA片段，而健康猪屎豆总DNA均未扩增出特异性DNA片段(图 3)。此2对引物均为植原体特异性引物，而且扩增DNA片段大小与预测片段大小相符，而阴性对照未能扩增出特异性的DNA片段，排除污染的因素，可以确定猪屎豆丛枝病是植原体侵染引起的。

2.2 DNA片断的序列分析

16S rDNA序列测定和分析结果显示，猪屎豆丛枝病植原体的扩增片段长为1 806个核苷酸(GenBank登录号为EU650181)，包括16S rDNA, 16S-23S rDNA间区和部分23S rDNA序列。猪屎豆丛枝病植原体与花生丛枝病植原体(GenBank登录号为L33765)和候选种Ca. Phytoplasma australasiae (GenBank登录号为Y10097)同源性最高，均为99.9%，与候选种Ca. P. aurantifolia(GenBank登录号为U15442)同源性为98.7%；与16SrXV组候选种Ca. Phytoplasa brasiliense(GenBank AF147708)同源性为96.9%；与其他候选种的同源性为82%~92%。根据植原体分类鉴定规定，即使与‘参考株’的16S rRNA基因序列差别再小, 也不能将其归‘属于’此候选种, 而只是与它相关(The IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team-Phytoplasma taxonomy group，2004)。因此猪屎豆丛枝病植原体与16Sr Ⅱ组Ca. Phytoplasa australasiae候选种相关，与花生丛枝病亲缘关系最近，与候选种Ca. Phytoplasa aurantifolia(16Sr Ⅱ组)和候选种Ca. Phytoplasa brasiliense(16SrXV组)的亲缘关系较近。

rp基因片段的序列分析结果显示，PCR扩增片段核苷酸序列长度为1 294 bp(GenBank登录号为EU650182)，包括核糖体蛋白基因L22 (rpl22)和S3(rps3)全部序列。猪屎豆丛枝病植原体与所选花生丛枝组植原体间序列同源性均在85%以上，其中与花生丛枝病植原体、苜蓿丛枝病植原体间的同源性分别为99.8%, 99.7%。与其他组所选序列同源性分别在60%~70%间。证明猪屎豆丛枝病植原体与花生丛枝病、苜蓿丛枝病植原体间关系最近，而苜蓿丛植病与Ca. Phytoplasa australasiae候选种相关，是16SrII-D亚组成员，因此rp基因片段的序列分析结果与16S rDNA序列分析的结果基本一致。

2.3 虚拟RFLP分析

虚拟RFLP分析结果见图 4和图 5。图 4为6个植原体(植原体基本信息见表 1)的MseⅠ酶切图，图 5为MaeⅢ和TaqⅠ酶切图。3个限制性内切酶的酶切片段中，猪屎豆丛枝病与16SrII-A亚组的花生丛枝病植原体所有的酶切片段的大小和数量完全相同，而16SrII-D的Ca.Phytoplasa australasiae间仅有MaeⅢ的酶切片段的大小和数量相同，而MseⅠ和TaqⅠ的酶切片段大小和数量均有部分差异，与其他3个亚组(16SrII-B亚组的Ca. Phytoplasa aurantifolia，16SrII-C亚组的Cotton phyllody，16SrII-E亚组的Picris echiodes phyllody)的3个内切酶的酶切片段大小和数量均有部分差异。因此猪屎豆丛枝病植原体应属16SrII，16SrII-A亚组的株系。

2.4 系统发育分析

用MEGA 3.1软件的NJ法和植原体15个组的23个16S rDNA序列以及Acholeplasma laidlawii的16S rDNA序列构建的Bootstrap系统发育树如图 6(系统树自展值表示1 000次重复检验得到的支持率)。Bootstrap检验的结果表明：系统发育树各分支的自展值除1个分支小于50以外(自展值为45)，其他分支均高于50，说明所构建的拓扑结构置信度较高。进化树明显地分成了4个大的稳定的分支，其中1个分支包括16SrⅡ组的6个植原体和16SrXV组的候选种Ca. Phytoplasa brasiliense。这个大的分支可再分成2个分支，1个分支是候选种Ca. Phytoplasa brasiliense，另1个分支则包括16SrⅡ组的6个植原体，在这个分支下又明显分成了5个小的分支，分别对应16SrⅡ组的5个亚组，分别为16SrII-A亚组的Peanut witches’-broom和Crotalaria witches’-broom、16SrII-B亚组的Ca. Phytoplasa aurantifolia, 16SrII-C亚组的Cotton phyllody、16SrII-D亚组的Ca.Phytoplasa australasiae和16SrII-E亚组的Picris echiodes phyllody。因此Crotalaria witches’-broom与Peanut witches’-broom遗传进化关系最近，其次为Ca. Phytoplasa australasiae。

利用植原体的13个rp基因序列以及A. laidlawii的rp基因序列构建的Bootstrap系统发育树如图 7(系统树自展值表示1 000次重复检验得到的支持率)。Bootstrap检验的结果表明：系统发育树各分支的自展值除1个分支小于50以外(自展值为46)，其他分支均高于50，说明利用rp基因序列构建的拓扑结构置信度也很高。从图中可知: 13个植原体分成了6个稳定的分支，其中1个大的分支包括7个16SrⅡ组的植原体(16SrII-A亚组的Peanut witches'-broom和Crotalaria witches’-broom, 16SrII-B亚组的Lime witches’-broom, 16SrII-C亚组的Cotton phyllody, 16SrII-D亚组的Tomato big bud和Alfalfa witches’-broom, Ca.Phytoplasa australasiae和16SrII-E亚组的Picris echiodes phyllody。rp基因的遗传进化图与16S rDNA的遗传进化图基本一致，Crotalaria witches’-broom与Peanut witches’-broom遗传进化关系最近，其次为16SrII-D亚组的Tomato big bud和Alfalfa witches’-broom。

3 结论与讨论

戴月明等(1981)通过电镜证明发生在我国广东省博罗县猪屎豆丛枝病害的病叶叶脉筛管内存在大小为90~100 nm的植原体细胞，此研究仅仅利用电镜证明猪屎豆丛枝病病原菌为植原体，未对病原菌进行深入研究。李永等(2006)应用16S rDNA的同源性分析，初步确定猪屎豆丛枝病植原体为植原体属，花生丛枝组成员，并未对其分类地位进行深入系统的研究和报道。本研究在前人研究的基础上，利用16S rRNA和rp 2个基因的序列分析、系统发育树构建以及16S rDNA序列的虚拟RFLP分析等方法从分子水平上对猪屎豆丛枝病植原体进行了系统鉴定。猪屎豆丛枝病植原体为16SrII，16SrII-A亚组的株系，与候选种Ca. Phytoplasa australasiae相关，与花生丛枝病植原体的遗传进化关系最近，其次为Ca. Phytoplasa australasiae。

在细菌中，16S rRNA基因和核糖体蛋白基因(rp)是细菌进化演变的2个重要基因，是系统发育的重要信号。本研究基于2基因构建的系统发育树主要分支的顺序有差异，16S rRNA基因系统发育树，组外对照A. laidlawii，然后是16SrⅡ组植原体，而rp基因系统发育树则距离最外对照A. laidlawii最远，详细的分支也不是完全平行的，但是进化树中的植原体间的遗传进化关系基本一致。Martini等(2007)在植原体株系关系和系统发育研究中，发现16S rRNA和rp基因构建的系统发育树主要分支的顺序基本一致，但详细的分支并不完全平行，rp基因可能比rRNA基因承受着更快的变异速度，因此rp基因系统发育树能描绘出更详尽的遗传进化关系，能揭示更多有价值的信息和系统发育的标记，用于rRNA基因不易区分的近缘株系的研究。2基因构建的系统发育树中16SrⅡ组植原体分支的5个小的分支是平行的，而且Crotalaria witches’-broom和Peanut witches’-broom都在一个小的分支上。说明Crotalaria witches’-broom和Peanut witches’-broom遗传进化关系非常近。

Wei(2007)等认为RFLP仍然是1个很好的工具。原因有3个，一是已经建立了权威的植原体RFLP分类系统和分类模式；二是虽然以序列分析为基础的同源性比较、遗传进化分析都可以用于植原体株系的分类鉴定，但RFLP仍然是1个很好的微生物多样性研究和分类鉴定的工具；另外虚拟RFLP方法方便快捷，而且更加准确，可以更好地应用于植原体的分类鉴定的研究。

酸枣(Choerospondias axillaris)是民间公认的野生宿主，酸枣和枣树间可以通过嫁接传染病菌(温秀军等，2005)，根据16S rDNA序列和tuf序列分析结果推测枣疯病(jujube witches’-broom)和酸枣丛枝病(Wild Jujube withches’-broom)为同一个种的不同寄主生物学型(王海妮等，2007年)。根据本研究序列分析的结果推测，猪屎豆和花生的关系很可能与酸枣和枣树的关系大小，猪屎豆是花生丛枝病植原体的野生宿主。植原体可通过嫁接和昆虫媒介传播，传播媒介昆虫主要为叶蝉和木虱(Phyllis et al., 2006)。花生丛枝病植原体的传毒虫媒为小绿叶蝉(Empoasca flavescens)，其成虫的最短获毒饲育时间为24 h以内，虫体循徊期9~11天，带毒成虫和若虫可终身传毒。陈慕容等(1994)认为此病的发病率的高低很可能与豆科绿肥种植面积有关。花生为1年生植物，而植原体不能靠种子和土壤传播，因此花生丛枝病的发生和流行必须有野生的病菌传播源。猪屎豆是农田和道路两旁边坡常见的绿肥植物, 发生丛枝病后，韧皮部的植原体病菌可常年存活和繁殖，是花生丛枝病植原体理想的野生寄主。对海南岛植原体病害调查，在发生猪屎豆丛枝病的地块，也发现臭矢菜丛枝及其他豆科植物丛枝病的发生，而花生种植的农田附近也有猪屎豆和臭矢菜丛枝病的发生，因此猪屎豆极有可能是花生丛枝病植原体的野生寄主。

本研究为花生丛枝病的病原菌的传播源的确定提供了分子依据，但不能肯定花生丛枝病的病原菌的转主寄主就是猪屎豆，因此有必要开展病原传播媒介，嫁接传毒等生物学方面的研究。通过进一步的分子证据和生物学实验证明栽培花生丛枝病与猪屎豆丛枝植原体之间的关系，将有助于海南豆科植物植原体病害流行规律的揭示和病害的防治。